唐 章，徐朝霞，李 亞，朱忠立，宋羽希，向朝雪，李福祥

危重癥患者無明確病因出現(xiàn)骨骼肌變性或（和）外周神經(jīng)損傷，并由此產(chǎn)生的一系列臨床表現(xiàn)被稱之為ICU獲得性衰弱(ICU-AW)。研究顯示，該病的發(fā)生與膿毒癥、機(jī)械通氣、長時間制動、高血糖狀態(tài)、激素及神經(jīng)肌肉阻滯劑應(yīng)用等因素有關(guān)[1]。隨著重癥監(jiān)護(hù)理念的發(fā)展，呼吸機(jī)的廣泛使用，ICUAW的發(fā)病率也隨之增加。然而，目前對于該病的診治仍未形成完善的臨床指南，制約該病研究的關(guān)鍵在于目前仍未有一種契合該病發(fā)病機(jī)制的實驗動物模型構(gòu)建方法。本研究擬通過對膿毒癥大鼠進(jìn)行制動來構(gòu)建一種簡便、易行的ICU-AW大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 10 w齡、體重393～421 g健康雄性SPF級SD大鼠[成都達(dá)碩公司，生產(chǎn)許可證號：scxk（川）2008-24]。 脂多糖內(nèi)毒素(LPS，北京索萊寶公司)，Atrogin-1引物、Murf1引物（成都擎科梓熙公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備[2]實驗大鼠72只，隨機(jī)分成 12 組（對照 3、6、9 d 組；制動 3、6、9 d 組；LPS 3、6、9 d 組；LPS 加制動 3、6、9 d 組），各 6 只。 大鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 ml/kg)全身麻醉后稱重，LPS組和LPS+制動組一次性腹腔注射LPS 5 mg/kg，對照組和制動組腹腔注射等體積生理鹽水。隨后將制動組和LPS+制動組大鼠持續(xù)固定于大鼠固定器制動至各分組時間點。對照組和LPS組置于鼠籠內(nèi)，各實驗鼠僅每天喂服葡萄糖氯化鈉溶液(5 ml/kg·h)，置于動物房，保持室溫24～30℃左右，24 h通風(fēng)排氣。

1.2.2 標(biāo)本制備 分別于分組后3、6、9 d處死各組相應(yīng)時間點大鼠，再次稱重。留取大鼠膈肌和雙側(cè)腓腸肌，將所取標(biāo)本一部分放入10%甲醛中24 h以上，剩余部分標(biāo)本放置于-80℃冰箱。

1.2.3 觀察指標(biāo) 組織形態(tài)學(xué)觀察：取上述經(jīng)甲醛固定的膈肌、腓腸肌組織標(biāo)本，浸蠟包埋，以厚度4 mm切片，脫蠟、至水、蘇木素染色5 min；自來水沖洗，鹽酸乙醇溶液分化30 s，于伊紅溶液中2 min；脫水、透明、封片。每個標(biāo)本于200倍光鏡下至少觀察5個切片，采用IPP6.0圖像分析軟件測定肌纖維橫徑，每張切片測5個視野，取平均值。

RT-PCR法檢測Atrogin-1和Murf1基因表達(dá)量：將研缽放置于冰上預(yù)冷，從-80℃冰箱中分別取出l00 mg腓腸肌和膈肌標(biāo)本，放入研缽內(nèi)，加入液氮反復(fù)磨細(xì)，加入1 ml Trizol充分勻漿，分別將腓腸肌和膈肌轉(zhuǎn)移至0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理后的EP管內(nèi)，加入 0.2 ml氯仿，劇烈振蕩 15 s，12 000 r/min，離心（4℃）15 min，取上清液；加入異丙醇 0.5 ml，充分混勻，于室溫 10 min，12 000 r/min，離心（4℃）10 min；棄上清液，加入1 ml 75%乙醇，洗滌沉淀，7500 r/min，離心（4 ℃）10 min；棄上清液，晾干，加入適量的DEPC H2O溶解。按照Akkad等[3]的基因序列設(shè)計引物，由成都擎科梓熙公司合成該引物，引物系列 ：Atrogin-1:5'-TCCTGGATCCAGAAGATTCA AC-3'(上 游)，5'-TCAGGGATGTGAGCTGTGACTT-3'(下游);Murf1:5'-ACCACCTCTGCCGGAAGTGT-3'(上游)，5'-CCGCGGTTGGTCCAGTAG-3'(下游)。 兩步法PCR擴(kuò)增測量Atrogin-1和Murf1基因表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，符合正態(tài)分布計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點體重比較 在各分組時間點，LPS+制動組體重均明顯低于其他3組（P＜0.05，表 1）。

表1 各組間不同時間點體重比較（n=6）

2.2 各組腓腸肌和膈肌組織形態(tài)學(xué)比較 在各分組時間點，LPS+制動組腓腸肌和膈肌纖維較其他各組明顯萎縮，且伴有纖維間隔不同程度增寬（圖1）。

圖1 各組腓腸肌形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)（HE染色，×200）

2.3 各組腓腸肌和膈肌纖維橫徑比較 對照組各時間點腓腸肌和膈肌纖維橫徑比較無顯著差異（P＞0.05），而其他3組均隨時間延長而逐漸減小；在各分組時間點，LPS+制動組腓腸肌、膈肌纖維橫徑均明顯小于其他3組（P＜0.05，表2）。

2.4 各組腓腸肌和膈肌Atrogin-1和Murf1 mRNA相對表達(dá)量比較 在各分組時間點，LPS+制動組腓腸肌、膈肌Atrogin-1、Murf1 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于其他 3組（P＜0.05）。 見表 3、4。

圖2 各組膈肌形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)（HE染色，×200）

表2 各組腓腸肌和膈肌纖維橫徑比較（n=6）

表3 各組腓腸肌Atrogin-1mRNA和Murf1?mRNA相對表達(dá)量比較（n=6）

表4 各組膈肌Atrogin-1mRNA和Murf1?mRNA相對表達(dá)量比較（n=6）

3 討論

ICU-AW可分為多發(fā)性肌病、多發(fā)性神經(jīng)病及多發(fā)性神經(jīng)肌病3種亞型[4]，而臨床常見為多發(fā)性肌病，因此，大多數(shù)研究均以該亞型建模。常用的建模方法有膿毒癥法、懸吊法、機(jī)械通氣法、激素誘導(dǎo)法等，但每種方法均存在不同缺點，故上述方法均未得到普及[5]。文獻(xiàn)顯示，膿毒癥不僅會導(dǎo)致實質(zhì)器官功能衰竭，還可以造成周圍神經(jīng)和骨骼肌損傷[6]。此外，制動（特別是長時間制動）是導(dǎo)致ICU-AW的另一重要原因[7]。因此，本研究在既往基礎(chǔ)上，兼顧可行性和臨床發(fā)病特征，采用LPS加制動建模。

病理檢查發(fā)現(xiàn)肌纖維萎縮和神經(jīng)軸突變性仍是目前確診本病的標(biāo)準(zhǔn)，但上述改變在發(fā)病早期并不明顯。而研究顯示，Murfl和Atrogin-1作為泛素-蛋白酶體途徑中兩個重要的特異性肌肉萎縮指標(biāo)，參與了泛素化過程[8]；由各種疾病所致骨骼肌萎縮中，都可以觀察到它們的特異性表達(dá)，故將其作為ICU-AW動物建模的早期觀察指標(biāo)[9]。

本研究結(jié)果提示，LPS+制動組大鼠相比較其他各組大鼠體重明顯下降，腓腸肌和膈肌纖維橫徑明顯減小，且隨著實驗時間的延長，這一效應(yīng)越顯著，說明LPS+制動組大鼠較其他組大鼠發(fā)生了骨骼肌萎縮。另外，在制動組大鼠中，腓腸肌纖維橫徑較對照組和LPS組明顯下降，說明制動在肢體肌肉萎縮上發(fā)揮著重要的作用，這可能是廢用性肌萎縮改變所致。而LPS組大鼠膈肌纖維橫徑較對照組和制動組明顯下降，說明膿毒癥狀態(tài)對膈肌萎縮也有一定影響，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在Atrogin-1、Murf1基因表達(dá)上，LPS+制動組大鼠較其他各組顯著增強(qiáng)。不僅如此，還發(fā)現(xiàn)Atrogin-1、Murf1基因表達(dá)是發(fā)生在建模的早期階段，并隨著實驗時間延長，表達(dá)量增多，說明泛素-蛋白酶體途徑參與了多發(fā)性肌病的發(fā)病過程，且其特異性標(biāo)記物的產(chǎn)生是先于形態(tài)學(xué)改變的，那么是否可以將此類標(biāo)記物用于多發(fā)性肌病的早期診斷，仍需實驗驗證。

綜上所述，腹腔注射LPS加制動可作為構(gòu)建ICU獲得性衰弱大鼠模型的方法，且該方法簡便、易行，同時符合ICU-AW發(fā)病機(jī)理，可用于ICU-AW發(fā)病機(jī)理、治療等的實驗研究。