李雪蓮，丁華，姜忠訓(xùn)，方渝，初曉麗，李延?xùn)|，張大微，戴婉波

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院產(chǎn)科，2.檢驗(yàn)科，3.病理科，廣東 深圳 518104)

早期自然流產(chǎn)是臨床常見的妊娠不良結(jié)局，妊娠期間母體通常對(duì)胚胎表現(xiàn)為生理性免疫耐受狀態(tài)，若發(fā)生免疫耐受失衡，則可造成流產(chǎn)[1-2]。既往普遍認(rèn)為，Th1/Th2失衡與早期自然流產(chǎn)密切相關(guān)。近年來研究顯示，Th17/Treg細(xì)胞在早期自然流產(chǎn)中同樣具有重要作用。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)在抗原遞呈細(xì)胞、T細(xì)胞激活、增殖、分化、凋亡過程中具有調(diào)控作用，其信號(hào)激活可導(dǎo)致Th1、Th17型免疫反應(yīng)下調(diào)，進(jìn)而加快Treg分化[3]。同時(shí)，Tim-3還可能介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)改變，抑制免疫應(yīng)答，在免疫耐受形成、維持中發(fā)揮重要作用。而Tim-3與Th17/Treg的相關(guān)性、Tim-3/Th17/Treg細(xì)胞模式在早期自然流產(chǎn)發(fā)生中的作用研究較少。本研究選取我院婦科門診早期自然流產(chǎn)患者、同期正常早孕自愿行人工流產(chǎn)者進(jìn)行分組對(duì)比，以探討Tim-3在早期自然流產(chǎn)中的作用及與Th17/Treg細(xì)胞的關(guān)系，為Tim-3/Th17/Treg細(xì)胞模式解釋早期自然流產(chǎn)患者母胎界面免疫耐受機(jī)制是否合理提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月至2017年3月我院婦科門診收治的30例早期自然流產(chǎn)患者作為研究組，年齡20～35歲，平均年齡(26.30±4.03)歲；孕周5～10周，平均孕周(7.63±0.22)周。另選取同期30例正常早孕自愿行人工流產(chǎn)者作為對(duì)照組，年齡19～34歲，平均年齡(26.17±3.93)歲；孕周5～9周，平均孕周(6.63±0.16)。均排除解剖異常如宮腔占位等；有害化學(xué)物質(zhì)、放射線接觸史者；孕早期發(fā)熱、服藥者；酗酒、吸煙等不良習(xí)慣者；存在內(nèi)外科合并癥和或并發(fā)癥者；屬于近親婚配者。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

1.2.1主要實(shí)驗(yàn)儀器 美國C6型流式細(xì)胞儀、日本4000型臺(tái)式離心機(jī)、LEICA顯微鏡、芬蘭ASCENT 酶標(biāo)比色儀、恒溫冰箱等。

1.2.2主要試劑和耗材 Ionomycin、PMA、Brefeldin A、Anti-Human-CD25-PE-Cyanine7、Anti human CD4-FITC、Anti-Human IL-17A-PE、Anti-Human TIM3-APC、Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒和免疫組化試劑盒。

1.3 研究方法

所有受檢者抽取6 mL靜脈血，3 mL置入肝素鈉抗凝管用于流式細(xì)胞檢測；3 mL放入干燥無菌EP管中離心后取血清-80℃保存,統(tǒng)一待測。取清宮后的蛻膜組織，立即用生理鹽水洗凈，10%福爾馬林固定24～48 h，石蠟包埋，統(tǒng)一切片待測。

1.3.1CD4+T Tim-3檢測 將100 μL新鮮EDTA抗凝外周血分別加入2支流式管，加入CD4-FITC、APC-CD3、PE-Tim-3抗體，避光孵育后加入紅細(xì)胞裂解液，破膜后避光孵育，PBS緩沖液洗滌，給予PBS(500 μL)重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+細(xì)胞中CD4+Tim-3，并設(shè)立同型對(duì)照。

1.3.2CD4+T Treg Tim-3 采用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離外周血單核細(xì)胞，洗滌后，加入CD4-FITC，CD25-PE-Cyanine7，TIM3-APC，避光孵育，加入破膜劑破膜，再次避光孵育后離心洗滌，重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+細(xì)胞中CD4+CD25+Treg+Tim-3細(xì)胞所占比例，同時(shí)設(shè)立同型對(duì)照。

1.3.3CD4+T Th17 Tim-3檢測方法 將外周血單核細(xì)胞分離后進(jìn)行洗滌、避光孵育，離心后加入TIM3-APC、CD4-FITC，加入破膜劑破膜后再次避光孵育，再將IL-17A-PE單抗加入，于4 ℃避光條件下孵育，時(shí)間為15 min，洗滌后重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+細(xì)胞中CD4+Th17+Tim-3細(xì)胞所占比例，同時(shí)設(shè)立同型對(duì)照。

1.3.4相關(guān)細(xì)胞因子檢測方法 外周血中Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，子宮蛻膜中Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)兩組PBMC中CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、CD4+T Treg Tim-3的表達(dá)水平及Th17/Treg Ratio；(2)Tim-3與Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)性；(3)兩組外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β的表達(dá)水平；(4)兩組子宮蛻膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β陽性表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 外周血單核細(xì)胞中CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、CD4+T Treg Tim-3、Th17/Treg Ratio的表達(dá)

研究組外周血單核細(xì)胞中CD4+T Treg Tim-3低于對(duì)照組，CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、Th17/Treg Ratio高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

2.2 Tim-3的表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)性

研究組Tim-3表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.898，P<0.05)。

2.3 外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平

研究組外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

組別CD4+T Tim-3(%)CD4+T Th17 Tim-3(%)CD4+T Treg Tim-3(%)Th17/Treg Ratio研究組5.22±1.432.74±1.021.27±0.691.46±0.65對(duì)照組1.39±0.691.30±0.573.00±0.811.04±0.54t值13.246.752.322.76P值<0.05<0.05<0.05<0.05

表2 兩組外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平比較[M(Q1，Q3)，pg/ml，n=30]

2.4 子宮蛻膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β陽性表達(dá)率

研究組子宮蛻膜Tim-3、IL-6、IL-17陽性表達(dá)率高于對(duì)照組(P<0.05)；兩組子宮蛻膜中TGF-β陽性表達(dá)率無明顯差異(P<0.05)，見表3。

表3 兩組子宮蛻膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β陽性表達(dá)率比較[n(%)，n=30]

3 討 論

自然流產(chǎn)屬于婦產(chǎn)科常見的妊娠并發(fā)癥，免疫學(xué)理論認(rèn)為，妊娠屬于同種半異體移植過程，其正常維持需依靠母體免疫耐受攜帶父系抗原的胎兒，若母胎間免疫失衡，則極易造成自然流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[4]。

Th17、Treg細(xì)胞來源于共同祖細(xì)胞，兩者可于不同因子作用下由T細(xì)胞分化成Th17、Treg細(xì)胞。Th17細(xì)胞可誘導(dǎo)發(fā)生炎癥、自身免疫性疾病等，對(duì)妊娠造成不良影響，而Treg則可通過免疫應(yīng)答保護(hù)胎兒組織。同時(shí)，相關(guān)研究表明，Th17細(xì)胞可通過增加產(chǎn)生IL-17發(fā)揮抑制Treg細(xì)胞增殖作用[5]。近年來，Th17/Treg亞群平衡狀態(tài)在妊娠維持中的作用受到臨床關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，與妊娠前相比，妊娠小鼠及人類母胎界面Treg表達(dá)呈現(xiàn)明顯升高趨勢，Th17/Treg亞群逐漸偏移向Treg，表明Th17/Treg在妊娠期間維持母胎免疫耐受中具有重要作用[6]。以往臨床針對(duì)早期自然流產(chǎn)通常以Th1/Th2模式來解釋，而Tim-3在免疫失衡及其相關(guān)細(xì)胞因子改變、Tim-3/Th17/Treg細(xì)胞模式在早期自然流產(chǎn)中的作用研究較少。Tim-3屬于Th1相關(guān)的負(fù)性共刺激因子，是一種Ⅰ型膜蛋白，可調(diào)控T細(xì)胞分化、增殖、凋亡，還可作為重要免疫調(diào)節(jié)分子，在免疫反應(yīng)、免疫耐受中具有關(guān)鍵性作用，不僅可參與T細(xì)胞免疫應(yīng)答，且于CD4+T細(xì)胞上呈現(xiàn)表達(dá)異常時(shí)與多種病毒感染、自身免疫性疾病等密切相關(guān)，而CD4+T細(xì)胞有不同的細(xì)胞亞型，其中包括Th17、Treg細(xì)胞亞型[7-8]。同時(shí)，相關(guān)研究顯示，Tim-3可通過結(jié)合配體，于Th17、Treg細(xì)胞上表達(dá)，抑制其分化，加速凋亡，最終導(dǎo)致免疫應(yīng)答下調(diào)[9-10]。

CD4+CD25+Treg屬于Treg特異性標(biāo)志，IL-17是由Th17細(xì)胞特異性分泌。因此，本研究試驗(yàn)中采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+IL-17、CD4+CD25+Treg水平，分別代表Th17、Treg細(xì)胞水平，結(jié)果表明，研究組PBMC中CD4+T Treg Tim-3低于對(duì)照組，CD4+T Tim-3、CD4+T Th17 Tim-3、Th17/Treg Ratio高于對(duì)照組，且研究組Tim-3表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞呈正相關(guān)(P<0.05)，可見早期自然流產(chǎn)中Tim-3呈現(xiàn)異常表達(dá)狀態(tài)，與Th17/Treg平衡偏移方向一致，且與Th17/Treg Ratio呈正相關(guān)。Th17細(xì)胞具有誘導(dǎo)粒細(xì)胞集落刺激因子、免疫炎癥細(xì)胞因子等表達(dá)的作用，且可與炎性因子發(fā)揮協(xié)同作用，導(dǎo)致炎性效應(yīng)增強(qiáng)，加快炎癥及免疫排斥反應(yīng)過程進(jìn)展；Treg則具有誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受作用，可誘導(dǎo)分泌IL-6、TGF-β[11-12]。本研究為進(jìn)一步明確Tim-3與Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在早期自然流產(chǎn)中的作用，分析了早期自然流產(chǎn)者與正常早孕自愿行人工流產(chǎn)者外周血及子宮蛻膜Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β水平。數(shù)據(jù)顯示，研究組外周血Tim-3、IL-6、IL-17、TGF-β高于對(duì)照組，子宮蛻膜中Tim-3、IL-6、IL-17陽性表達(dá)率高于對(duì)照組(P<0.05)，分析其原因，Tim-3信號(hào)通路可參與抗原特異性CD4+CD25+Treg生成及其免疫抑制功能，其表達(dá)異常時(shí)可減少Treg細(xì)胞數(shù)量，從而造成Th17/Treg失衡，減弱抑制CD4+T細(xì)胞增殖作用，進(jìn)而破壞母胎界面免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)平衡，最終導(dǎo)致胚胎丟失。由此可見，Tim-3不僅與Th17/Treg Ratio呈正相關(guān)，還可介導(dǎo)Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子改變，在早期自然流產(chǎn)中可能發(fā)揮著重要作用。隨著不斷深入研究，Tim-3有望成為早期自然流產(chǎn)的特異性指標(biāo)。同時(shí)，以往的研究發(fā)明，Tim-3可特異性表達(dá)于Th1細(xì)胞，且Th17/Treg細(xì)胞失衡可產(chǎn)生大量Th1型細(xì)胞因子。因此與Th1/Th2細(xì)胞模式相比，Tim-3/Th17/Treg細(xì)胞模式在解釋早期自然流產(chǎn)患者母胎界面免疫耐受機(jī)制方面可能更為精準(zhǔn)，為早期自然流產(chǎn)發(fā)生機(jī)制提供較為可靠依據(jù)。

綜上所述，Tim-3在早期自然流產(chǎn)中呈現(xiàn)異常表達(dá)狀態(tài)，與Th17/Treg Ratio呈正相關(guān)，與Th17/Treg細(xì)胞失衡、相關(guān)細(xì)胞因子改變密切相關(guān)。通過檢測Tim-3水平，可能有助于臨床及時(shí)判斷早期自然流產(chǎn)發(fā)生及進(jìn)展情況，可為臨床治療提供理論依據(jù)，以便制定合理治療方案。