蘇 英，吳榮華，申君宇，李偉平，何 滔，李 云，丁詩(shī)華

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

大鯢(Andriasdavidianus)俗名“娃娃魚”，隸屬于兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，為國(guó)家二級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)、藥用及觀賞價(jià)值[1]。弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，普遍存在于土壤、酸性溫泉、放射性廢物、水和地殼深處，可在植物和動(dòng)物的活體中生長(zhǎng)[2]，可感染人和動(dòng)物，引起腹瀉、食物中毒和繼發(fā)感染[3]，是一種典型的人-獸-魚共患病條件性致病菌[4]。弗氏檸檬酸桿菌對(duì)水生動(dòng)物的致病性報(bào)道較多。1982年，Sato等[5]從皮膚腐爛、出血的翻車鲀(Molamola)體內(nèi)分離到弗氏檸檬酸桿菌。隨后，又有關(guān)于弗氏檸檬桿菌引起鱘(Acipenserschrenckii)、花鰻鱺(Anguillamarmorata)等發(fā)病死亡的報(bào)道[6-7]。2001年，李華等[8]首次報(bào)道了弗氏檸檬酸桿菌可引起河蟹(EriocheirsinensisH.)敗血癥，也可引起紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)、中華鱉(Trionyxsinensis)、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)等患病[9-11]。由于該菌對(duì)抗生素的敏感性因宿主來(lái)源而異[6-11]，因此有必要對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性分析，以期為疾病治療提供科學(xué)參考依據(jù)。

本研究從患病大鯢內(nèi)臟器官分離得到一株優(yōu)勢(shì)病原菌，對(duì)分離菌株采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測(cè)定和16S rRNA、aspC管家基因測(cè)定進(jìn)行鑒定，確定其為弗氏檸檬酸桿菌。人工感染發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)健康大鯢具有很強(qiáng)的致病性，胞外酶分析發(fā)現(xiàn)其致病性可能跟其產(chǎn)生卵磷脂酶相關(guān)。同時(shí)，對(duì)分離菌株開(kāi)展了藥物敏感性試驗(yàn)，以期為大鯢細(xì)菌性疾病的防治提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料

重慶梁平某大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)，2017年5月開(kāi)始陸續(xù)有大鯢死亡，死亡的大鯢為2齡成體魚，體重在500 g左右，損失較大。發(fā)病水溫一般在21 ℃，溫度越高，發(fā)病率越高，溫度低于21℃也發(fā)病，但發(fā)病率較低。病鯢外部癥狀主要表現(xiàn)為腹部腫大、食欲不振、四肢充血潰爛和口腔發(fā)炎充血，剖檢可見(jiàn)胃、腸道充血。144尾(500±40)g健康大鯢與發(fā)病大鯢是同一個(gè)品系，購(gòu)買自武隆某大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)，避光暫養(yǎng)于水溫25 ℃的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，暫養(yǎng)一周后無(wú)異常癥狀，用于后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑

細(xì)菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。2×Taq MasterMix購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

在超凈工作臺(tái)中，用酒精棉擦拭病鯢體表，無(wú)菌解剖，接種環(huán)蘸取胃、腸、肝、腎、脾組織，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)特征一致的菌落進(jìn)行劃線純化，獲得純培養(yǎng)。分離菌株接種于腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)28 ℃培養(yǎng)24 h，與40%無(wú)菌甘油等體積均勻混合，置于-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株int1705接種于NA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，記錄其菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

1.2.2.2 生理生化特性測(cè)定

將-80 ℃ 保存的純化菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，接種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行細(xì)菌鑒定。胞外酶活性(溶血活性、酯酶、脲酶、淀粉酶、卵磷脂酶、明膠酶)檢測(cè)根據(jù)陳言峰等[12]和Rozhavin等[13]的方法進(jìn)行。

1.2.2.3 16S rRNA和aspC基因的序列分析

根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取菌株基因組DNA，以分離菌株基因組DNA做為模板，用細(xì)菌16S rRNA 通用引物(正向引物5′→3′：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物5′→3′：GGTTACCTTGTTACGACTT)、aspC管家基因引物(正向引物5′→3′：GTTTCGTGCCGATGAACGTC；反向引物5′→3′：AAACCCTGGTAAGCGAAGTC)分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq MasterMix 25 μL，DNA 模板(100 ng/μL)4 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各2 μL，加入ddH2O 至總?cè)萘繛?0 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃/56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像儀中進(jìn)行產(chǎn)物分析并拍照，然后回收產(chǎn)物，送至北京六合華大基因進(jìn)行測(cè)序分析。

將分離菌株的16S rRNA 及aspC管家基因序列通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI )中BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，并進(jìn)行比對(duì)。使用軟件MEGA5.1中鄰接法(NJ,Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，步展值(Bootstrap value)設(shè)為1 000進(jìn)行置信度檢測(cè)。

1.2.3 人工感染試驗(yàn)

將分離菌株int1705接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，4 000g離心10 min，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌沉淀3次，麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定細(xì)菌濃度。調(diào)整菌液濃度為五個(gè)梯度。暫養(yǎng)后的健康大鯢隨機(jī)平均地分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組各8尾。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射1 mL濃度為1×109、1×108、1×107、1×106和1×105CFU/mL的菌液，對(duì)照組注射同體積的0.01 mol/L無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都設(shè)置三個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)期間保持水溫25 ℃，溶氧充足。每天觀察大鯢活動(dòng)情況，記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況，對(duì)瀕死大鯢進(jìn)行解剖觀察，從肝臟、脾臟、腎臟、腸道、胃分離純化致病菌菌株。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的半致死濃度(LD50)采用累計(jì)法(Reed-Muench)計(jì)算。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法(KB,kirby-baner法)對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。通過(guò)麥?zhǔn)媳葷岱?，調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)(1.5×108cfu/mL)，無(wú)菌條件下使用無(wú)菌棉棒均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板。用無(wú)菌鑷子取待測(cè)藥敏紙片，貼于MH培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑。根據(jù)杭州微生物試劑有限公司說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)，判斷藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離純化

從大鯢胃、腸、肝臟、腎臟、脾臟取樣于NA培養(yǎng)基上劃線，經(jīng)28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，從胃、腸、脾臟均獲得一株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，編號(hào)int1705。分離菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)良好。

2.2 人工感染試驗(yàn)

int1705菌株對(duì)每尾大鯢LD50為3.16×106CFU/mL。注射組大鯢出現(xiàn)不同程度的死亡情況，注射PBS的對(duì)照組未出現(xiàn)死亡(如圖1所示)。發(fā)病大鯢主要癥狀為口腔發(fā)炎潰爛、后肢充血潰爛、腸胃出血和膽囊腫大等癥狀(圖2)。從發(fā)病大鯢的腸道、胃部、脾臟充血處分離得到優(yōu)勢(shì)菌株，表明菌株int1705是大鯢此疾病的病原菌。

圖1 大鯢注射不同濃度int1705菌株的累積死亡率Fig.1 Cumulative mortality of A.davidianus challenged with different doses of int1705 via intraperitoneal injection

圖2 大鯢發(fā)病癥狀Fig.2 The symptoms of hemorrhagic tissues A:口腔潰爛出血；B: 充血潰爛的后肢；C:胃腸充血

2.3 細(xì)菌鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

菌株int1705在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落形態(tài)呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，中央稍微凸起，為乳白色，菌落直徑2～4 mm。革蘭氏染色為陰性，鏡檢觀察其為兩端鈍圓，長(zhǎng)2～6 μm，直徑1 μm的短桿菌(圖3)。

圖3 int1705菌株的革蘭染色Fig.3 Gram staining of the int1705 strain

2.3.2 生理生化特性

菌株int1705生理生化特性見(jiàn)表1。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，菌株int1705的生理生化特性符合弗氏檸檬酸桿菌特征。

對(duì)菌株int1705溶血酶、脂酶、脲酶、淀粉酶、明膠酶的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，卵磷脂酶的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

表1 int1705菌株的生理生化特性

2.3.3 16S rRNA基因和aspC管家基因序列分析

菌株int1705的16S rRNA、aspC基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4(泳道3和泳道4)所示，序列長(zhǎng)度分別為1 442 bp和502 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致，陰性對(duì)照(泳道1和2)無(wú)條帶出現(xiàn)。

圖4 分離株int1705的16S rRNA及aspC基因序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 The electrophoresis results of 16S rRNA and aspC gene fragments from int1705泳道M：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；泳道1-2：aspC和16S rRNA基因序列PCR陰性對(duì)照。泳道3-4：aspC和16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

將獲得的序列在NCBI的BLAST系統(tǒng)中進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果表明分離株int1705的16S rRNA 基因與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii，登錄號(hào)為KC210829.1)的同源性達(dá)99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果(見(jiàn)圖5)顯示，分離株int1705與弗氏檸檬酸桿菌處于同一分支。aspC 管家基因序列分析結(jié)果顯示與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii，登錄號(hào)為HQ111096.1)的同源性達(dá)99%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果(見(jiàn)圖6)亦顯示與弗氏檸檬酸桿菌處于同一分支。

圖5 int1705菌株16S rRNA 基因序列與部分相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of int1705 and related strains

圖6 int1705菌株aspC 序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on aspC sequences of int1705 and related strains

2.4 藥物敏感性

菌株int1705對(duì)多粘菌素B、丁胺卡那、羧芐西林、哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、諾氟沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明等10種藥物敏感，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素和多西環(huán)素等5種藥物中度敏感，對(duì)苯唑西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、克林霉素、麥迪霉素、新霉素、青霉素等7種抗菌藥物存在不同程度的耐藥性，詳細(xì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 分離株的藥物敏感性

注：S：敏感；I：中度敏感；R：耐藥。

3 討論

過(guò)去認(rèn)為弗氏檸檬酸桿菌是腸道致病菌，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，臨床上毒力較強(qiáng)的菌株可能穿過(guò)腸道黏膜，進(jìn)而在全身擴(kuò)散傳播，引起機(jī)體系統(tǒng)感染，而不僅僅局限于腸道感染[4]。張冬星等[14]的研究中，發(fā)現(xiàn)弗氏檸檬酸桿菌可引起團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)肛門紅腫，腹腔積液，魚鰾和肝嚴(yán)重出血，腎、脾腫大等病理性變化。盧君輝等[15]從烏翅真鯊(Carcharhinusmelanopterus)病魚肝臟、腹腔及腸道中分離得到弗氏檸檬酸桿菌。其他研究表明弗氏檸檬酸桿菌可導(dǎo)致錦鯉(CyprinuscarpioL.)、鯽(Carassiusauratus)發(fā)病[16-17]，病魚主要表現(xiàn)豎鱗、皮膚腐爛、腹腔積液和肛門紅腫等癥狀。本試驗(yàn)從患病大鯢體內(nèi)分離的int1705，經(jīng)過(guò)16S rRNA和aspC保守序列測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與弗氏檸檬酸桿菌的同源性高達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性將該菌株鑒定為弗氏檸檬酸桿菌。菌株經(jīng)回歸感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可使健康大鯢患病，感染器官組織與其他宿主較為一致，都有皮膚腐爛，腹腔積液，組織充血的病理性特征。從回歸感染的患病大鯢分離的病原菌的生理生化特性和16S rRNA保守序列與分離株int1705一致，因此確認(rèn)該菌株為導(dǎo)致大鯢出現(xiàn)腹腔腫脹、皮膚潰爛癥狀的病原菌?；貧w感染試驗(yàn)測(cè)得該菌對(duì)大鯢的半致死濃度(LD50)為3.16×106CFU/mL。通過(guò)選擇培養(yǎng)基檢測(cè)弗氏檸檬酸桿菌可能產(chǎn)生的外毒素，結(jié)果顯示，菌株int1705不產(chǎn)生溶血素、酯酶、脲酶、淀粉酶、溶膠酶，產(chǎn)生卵磷脂酶，能造成細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致其出現(xiàn)充血潰爛等癥狀[18]。其致病機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

弗氏檸檬酸桿菌對(duì)抗生素的敏感性因宿主來(lái)源和環(huán)境而異。從印度病人腸道分離和引起東北虎出血性腹瀉的弗氏檸檬酸桿菌具有不同的耐藥性[19,20]。而在水生動(dòng)物中，不同魚類來(lái)源的弗氏檸檬酸桿菌的耐藥情況也有所不同。大鯢源的int1705與施氏鱘[6]、河蟹[8]、紅螯螯蝦[9]來(lái)源的致病性弗氏檸檬酸桿菌藥敏結(jié)果存在差異：int1705對(duì)新霉素耐藥，對(duì)多粘菌素B敏感，而來(lái)源于施氏鱘的弗氏檸檬酸桿菌對(duì)新霉素敏感，對(duì)多粘菌素B耐藥；來(lái)源于河蟹的菌株對(duì)四環(huán)素耐藥，來(lái)源于紅螯螯蝦的菌株對(duì)四環(huán)素敏感，而int1705對(duì)四環(huán)素中度敏感。因此在養(yǎng)殖過(guò)程中如發(fā)生細(xì)菌性病害應(yīng)及時(shí)進(jìn)行病原分離和藥敏試驗(yàn)，以篩選出敏感藥物有針對(duì)性地進(jìn)行治療。