馬晨陽 楊勇*

肺癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤首位，且在中國上升趨勢明顯［1］。目前對肺癌的防治主要為控?zé)熀驮缙谠\斷篩查，其中肺癌早期診斷篩查處于關(guān)鍵地位。若能早期篩查到肺癌病變，并手術(shù)切除，肺癌患者的5年生存率可得到較大提高［2］。近年來隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）在腫瘤的早期診斷和防治方面扮演了重要角色，而由其在DNA甲基胞嘧啶雙加氧酶1（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1，TET1）調(diào)控腫瘤機(jī)制成為新的熱點(diǎn)。研究表明，TET1作為一個(gè)重要的催化酶參與了DNA的主動去甲基化過程［3］，并且與胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。由于肺癌早治療、高生存的優(yōu)勢，尋求可能的判斷早期肺癌，檢測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記具有較高價(jià)值。本研究利用TCGA公共數(shù)據(jù)，探討TET1在肺腺癌（LUAD）中的表達(dá)和預(yù)后情況，并預(yù)測其參與LUAD發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究所采用的數(shù)據(jù)均來源于腫瘤 基 因 組 圖 譜（Cancer Genome Atlas，TCGA）（ 美國National Cancer Institute和National Human Genome Research Institute聯(lián)合啟動項(xiàng)目），數(shù)據(jù)收集了截至2019年1月的LUAD組織樣本及臨床預(yù)后數(shù)據(jù)（包括mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床資料）。通過多種在線TCGA數(shù)據(jù)分析工具，包括可視化工具 cBioPortal［4］和 GEPIA［5］等，對TET1在LUAD中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有其他腫瘤病史；（2）存在基本資料缺失患者。

1.2 研究方法 本研究首先通過GEPIA分析TCGA的LUAD數(shù)據(jù)庫，比較TET1基因在LUAD和正常組織中的表達(dá)差異，并對其臨床病理分期和總生存預(yù)后進(jìn)行相關(guān)分析，確定TET1基因在LUAD中的醫(yī)學(xué)研究價(jià)值。然后通過cBioPortal分析比較TET1在TCGA數(shù)據(jù)庫多個(gè)數(shù)據(jù)集的LUAD基因轉(zhuǎn)錄組（RVAseqV2，raw count）的總體表達(dá)水平，排除個(gè)體與組織取樣時(shí)間的差異。研究TET1基因拷貝數(shù)變異、甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性，推測TET1基因在LUAD發(fā)生作用的機(jī)制。同時(shí)檢測TET1基因與臨床常見LUAD驅(qū)動基因EGFR、TP53的相關(guān)性，并對TET1、EGFR、TP53三個(gè)基因通過cBioPortal的Network功能和STRING［6］進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，確認(rèn)TET1區(qū)別于EGFR、TP53在LUAD中的獨(dú)特作用，即作為不同于傳統(tǒng)LUAD驅(qū)動基因的新型基因靶點(diǎn)地位。在獲取TET1的共表達(dá)基因后，與來源于TCGA和GEO的LUAD數(shù)據(jù)集所共有的高表達(dá)基因（P-value＜0.001，|FoldChange|＞2.02）進(jìn)行venn圖分析，找出確定的基因組，并將基因組集導(dǎo)入DAVID分析工具［7］進(jìn)行GO基因集富集分析和通路分析，并使用funrich3.1.3導(dǎo)出效果圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。生存分析使用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其它基因表達(dá)與CNV的相關(guān)性以及共表達(dá)蛋白的相關(guān)性使用Spearman（相關(guān)系數(shù)：1代表完全線性正相關(guān)，0不相關(guān)，-1完全線性負(fù)相關(guān)）和Pearson檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)（0.8～1.0極強(qiáng)相關(guān)，0.6～0.8強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.6中等程度相關(guān)，0.2～0.4弱相關(guān)，0.0～0.2極弱相關(guān)或無相關(guān)），R＞0.3且P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。富集功能分析采用Fisher檢驗(yàn)，P＜0.05為功能富集有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TET1在LUAD及正常肺組織中的表達(dá)情況 GEPIA分析TET1在LUAD、肺鱗癌（LUSC）與相鄰正常肺組織的表達(dá)情況，結(jié)果見圖1。圖1A表明在TCGA數(shù)據(jù)庫中，TET1基因在LUAD組和LUSC組的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示TET1在LUAD和LUSC的表達(dá)水平均顯著高于相鄰正常組織（P＜0.05）。圖1B通過oncomine在線分析工具對TET1在非小細(xì)胞肺癌及正常肺組織的表達(dá)情況再次分析，以對GEPIA的結(jié)果驗(yàn)證，結(jié)果顯示TET1在LUAD的表達(dá)量仍高于正常肺組織。因此，由以上重復(fù)驗(yàn)證可推斷TET1在LUAD的表達(dá)量確實(shí)高于正常肺組織（P＜0.05）。

圖1 TET1基因在不同非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)情況［A：TET1在LUAD、LUSC與正常肺組織表達(dá)水平的情況；B：TET1在正常肺（1）、LUAD（2）、大細(xì)胞肺癌（3）、LUSC（4）與正常肺組織表達(dá)水平的情況］

2.2 TET1表達(dá)水平對LUAD患者預(yù)后的影響 GEPIA分析在LUAD中TET1高低表達(dá)水平對患者的病理分期及其生存預(yù)后的情況，結(jié)果見圖2。圖2A表明隨著LUAD臨床病理的不斷惡化，TET1的表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢，而LUADⅠ期的TET1表達(dá)水平雖然最大值與后期表達(dá)水平相當(dāng)，但其中位數(shù)仍低于后期表達(dá)水平，這可能是由于樣本個(gè)體數(shù)據(jù)所造成的偏倚。可見在不同的病理總分期之間的TET1表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.04），且隨病理分期的增加TET1基因的表達(dá)水平逐漸上升。圖2B表明LUAD患者的總生存期與TET1基因表達(dá)水平的相關(guān)性，與TET1基因高表達(dá)（n=239）相比，TET1基因低表達(dá)（n=226）的LUAD患者總生存率［P=0.045；HR=1.4，P（HR）=0.046］明顯降低，可見TET1高表達(dá)患者的生存時(shí)間較短，預(yù)后較差。

圖2 TET1基因在LUAD病理分期的情況及生存預(yù)后（A：TET1在不同LUAD病理分期的表達(dá)情況；B：TET1表達(dá)水平與LUAD患者生存時(shí)間的相關(guān)性）

2.3 納入分析的人群基本特征 cBioPortal分析選 擇TCGA數(shù) 據(jù) 集Lung Adenocarcinoma（TCGA，Provisional），共納入的586例LUAD樣本。其中男242例（41.4%），女280例（47.9%）；除去年齡未知的數(shù)據(jù)，平均年齡（65.619±9.914）歲；LUAD病理分期Ⅰ期（包括Ⅰ、ⅠA、ⅠB）有279例（47.8%），Ⅱ期（包括Ⅱ、ⅡA、ⅡB）有124例（21.3%），Ⅲ期（包括ⅢA、ⅢB）有85例（14.6%），Ⅳ期有26例（4.5%），此外分期未知70例（12.0%）；除去未知數(shù)據(jù)外，平均腫瘤直徑（1.18±0.515）cm。

2.4 TET1基因的拷貝數(shù)變異、甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 cBioPortal在線分析工具可對TCGA數(shù)據(jù)庫LUAD（TCGA，Provisional）數(shù)據(jù)集中TET1基因拷貝數(shù)變異、甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性情況進(jìn)行分析?？截悢?shù)變異（Copy number variation，CNV）指＞1kb DNA大片段的缺失（Deletion）、增加（Duplication）或倒置（Inversion），作為一種基因組多樣性形式，在癌癥發(fā)展過程中起著重要作用。TET1基因的拷貝數(shù)變異（CNV）主要集中于 Diploid、Gain和 Shallow Deletion，其中 Diploid為二倍體，即沒有拷貝數(shù)變異，Shallow Deletion是拷貝數(shù)的輕度丟失，Gain是輕度拷貝數(shù)擴(kuò)增。隨著DNA甲基化水平的不斷上升，TET1基因的表達(dá)量逐漸下降，兩者呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性較弱（Spearman：r=-0.33，Pearson：r=-0.13，P＜0.001）。總之，TET1 mRNA Sqe分析表明TET1基因在LUAD中雜合缺失、低水平基因擴(kuò)增的頻率較高，而其與DNA甲基化相關(guān)性較小。

2.5 TET1基因與臨床常見LUAD驅(qū)動基因的相關(guān)性 目前臨床常用的檢測LUAD驅(qū)動基因主要為EGFR、TP53，其與患者的治療、預(yù)后密切相關(guān)。作為近年熱門的免疫治療，EGFR、TP53基因突變是治療的優(yōu)勢靶點(diǎn)。本研究將結(jié)合EGFR、TP53基因，通過cBioPortal在線分析工具分析在TCGA數(shù)據(jù)庫LUAD（TCGA，Provisional）數(shù)據(jù)集中TET1基因與兩者的相關(guān)性。結(jié)果顯示，EGFR與TP53基因共表達(dá)趨勢顯著（P＜0.001，q＜0.001），TET1與 TP53基因的存在共表達(dá)趨勢（P=0.012），存在顯著的共表達(dá)趨勢，而其與EGFR基因則無顯著相關(guān)性（P=0.061）。通過GEPIA對TET1與EGFR、TP53兩者在LUAD的相關(guān)性再次進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在整合所有TCGALUAD數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)TET1與EGFR呈弱相關(guān)性（R=0.3，P=3.4e-11），而TET1與TP53兩者呈極弱相關(guān)性（R=0.11，P=0.017）。這與cBioPortal單數(shù)據(jù)集分析結(jié)果較一致，綜合兩者分析，可以認(rèn)為TET1與EGFR、TP53基因的相關(guān)性較弱，可能是不同于傳統(tǒng)EGFR、TP53基因的新型LUAD靶點(diǎn)基因。

2.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析（PPI） 通過cBioPortal的Network功能和STRING對TET1、EGFR、TP53三個(gè)基因進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，確認(rèn)TET1區(qū)別于EGFR、TP53在LUAD中的獨(dú)特位置。通過cBioPortal的Network功能，共篩選出TET1、EGFR、TP53基因的共表達(dá)基因如下：ACTB、ACTG1、AGO2、AKT1、AKT2、AKT3、BAZ1B、CCNK、CDH10、CDH12、CDH18、CDH6、CDH9、CDKN2A、COP1、DDR2、DROSHA、DVL3、DYRK1A、EGFR、FCGR1A、FCGR3A、FOXA1、GAB2、GDNF、GRB2、HGS、MAPK14、MAPKAPK、MCL1、MDM4、MET、NDRG1、NF1、PDP1、PIK3CA、PIP4K2B、PITPNA、PRKAB2、PRKD1、PRKDC、PTK2、S100A2、SHC1、SKP2、SPTA1、STK11、STK17A、TERT、TET1、TP53、TP53INP1、TRIO。將基因納入Network網(wǎng)絡(luò)后，EGFR和TP53在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位，與絕大多數(shù)的共表達(dá)基因節(jié)點(diǎn)相連接，而TET1由于聯(lián)系較弱，并未出現(xiàn)在Network網(wǎng)絡(luò)中。通過STRING對以上共表達(dá)基因進(jìn)行再次驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)TET1基因處于PPI網(wǎng)絡(luò)的邊緣位置，與EGFR、TP53基因無直接連接節(jié)點(diǎn)，間接連接節(jié)點(diǎn)僅AKT1。綜合相關(guān)性分析和PPI網(wǎng)絡(luò)分析，說明TET1確實(shí)與傳統(tǒng)LUAD驅(qū)動基因EGFR、TP53無明顯相關(guān)，可能是作為一種獨(dú)立的驅(qū)動基因?qū)UAD的發(fā)生發(fā)展起作用的。

2.7 TET1的共表達(dá)基因 通過cBioPortal分析方法對TET1在LUAD的共表達(dá)基因進(jìn)行篩選，結(jié)果的P值從小到大進(jìn)行排序，選取P值最小的前100個(gè)共表達(dá)基因。同時(shí)通過Cancer RNA-Seq Nexus［8］下載TCGA和GEO的LUAD基因數(shù)據(jù)集組，對高表達(dá)基因進(jìn)行篩選去重處理（P-value＜0.001，|FoldChange|＞2.02），得到三組基因集，分別為早期LUAD與正常肺組織對照所得的高表達(dá)基因，中晚期LUAD與正常肺組織對照所得的高表達(dá)基因以及GEO數(shù)據(jù)庫（GES40419）中LUAD與正常肺組織對照所得的高表達(dá)基因，通過Venn圖進(jìn)行分析后確定共表達(dá)的基因組。將共表達(dá)基因組與cBioPortal分析方法所得的TET1共表達(dá)基因組再次進(jìn)行Venn圖分析，確定TET1在LUAD有13個(gè)共表達(dá)基因，分別為TET1、DNMT3A、MEX3A、PAPOLA、SMC6、XPO5、ATAD2B、ZNF146、ZNF260、HMOX2、CCAR1、TRADD、TMEM219。

2.8 TET1基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 在獲取TET1的共表達(dá)基因后，通過cBioPortal的Network功能將共表達(dá)基因?qū)?，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示：基因 MRPL54、TRADD、CTSD、CD74、MAPKAPK3、PRPF4B、RPS6KA1、GNA1S、CLTB、PSMB10、SOS1、SPSF6、TREM2、LGALS3、OAZ1處 于 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心地位，有多個(gè)Node相連接。其中，RPS6KA1、MAPKAPK3、CTSD、CD74、LGALS3 為現(xiàn)有藥物的靶點(diǎn)。

2.9 TET1基因集富集分析及通路預(yù)測 通過對TET1基因相關(guān)共表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，TET1基因與一些基因表達(dá)水平存在明顯的關(guān)聯(lián)，對包括TET1相關(guān)表達(dá)GO功能富集分析（見表1），發(fā)現(xiàn)這些共表達(dá)基因的細(xì)胞組分主要集中在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，生物學(xué)功能主要集中于調(diào)控堿基、核苷功能，分子功能富集主要在DNA連接和轉(zhuǎn)錄活動的調(diào)控。因此，TET1相關(guān)共表達(dá)基因主要通過遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。表1表明三條通路 HSA-212165、HSA-74160、HSA-5334118與TET1基因具有相關(guān)性。提示對TET1基因在LUAD的機(jī)制分析可從這三條通路考慮，且此三條通路的功能與go注釋分析結(jié)果，遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)腫瘤相一致。

表1 TET1的通路分析

3 討論

LUAD作為惡性程度較高的呼吸道腫瘤，若早期未發(fā)現(xiàn)，常會錯(cuò)過最佳治療時(shí)期，放療、化療等綜合治療對患者生存時(shí)間的改善甚微，其治療的首選方案為手術(shù)，但長期的臨床實(shí)踐表明，對于LUAD單純手術(shù)的治療效果有限［2］。因此，早期發(fā)現(xiàn)并診斷LUAD成為目前迫在眉睫的問題。通過對LUAD基因的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了以前的基因研究尚不完善。在過去的幾十年里，有一些分子標(biāo)志物被研究出來，作為LUAD早期診斷的基因標(biāo)志物。

DNA甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要角色，其通過沉默抑癌基因表達(dá)而影響腫瘤進(jìn)程，而DNA去甲基化則可使抑癌基因再表達(dá)。TET1基因作為DNA去甲基化酶在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著不同的改變，其對于腫瘤的密切關(guān)系與日俱增。LUAD患者存在TET1基因突變頻率增加的情況，并且LUAD中TET1大多數(shù)的變異是基因缺失，TET1基因主要是通過腫瘤細(xì)胞周期抑制劑調(diào)控腫瘤進(jìn)展。在胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TET1表達(dá)水平的降低常伴隨5hmC水平降低［9］，表明5hmC也可能在TET1蛋白的作用下通過去甲基化作用抑制抑癌基因的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)動物腫瘤種植模型上，有研究者觀察到小鼠TET1基因的敲除會強(qiáng)化腫瘤細(xì)胞的侵襲能力、生長速度及轉(zhuǎn)移能力［10］，并發(fā)現(xiàn)5hmC水平的相應(yīng)變化。這可能是由于TET1表達(dá)降低導(dǎo)致抑癌基因沉默，最終使正常細(xì)胞惡變并促其增殖。但TET1基因還存在一些不足，其在非實(shí)體腫瘤的檢測中也有升高，如在白血病中等等。所以，通過認(rèn)識、了解TET1基因的改變特點(diǎn)，有可能為LUAD的早期診斷及治療提供新的思路和方法。

本研究結(jié)果表明，在LUAD中TET1基因表達(dá)上升是一種預(yù)后較差的因素。利用 TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)TET1基因在LUAD中特異性高表達(dá)，且TET1高表達(dá)的LUAD患者總生存預(yù)后較差。對TET1基因的CNV、甲基化水平與其mRNA的表達(dá)水平的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)TET1基因在LUAD中雜合缺失、低水平基因擴(kuò)增的頻率較高，而其與DNA甲基化相關(guān)性較小。臨床常檢測驅(qū)動基因TP53、EGFR在LUAD中的表達(dá)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TET1基因與兩者無顯著相關(guān)，而PPI網(wǎng)絡(luò)分析也驗(yàn)證了這一結(jié)果，可見TET1基因可能作為一種獨(dú)立的LUAD驅(qū)動基因?qū)UAD的發(fā)生、發(fā)展起到作用。

再次對TET1基因功能的研究通過共表達(dá)基因的方式進(jìn)行，對TET1共表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)DNMT3A、DNMT3L、CCAR1與TET1基因存在明顯的上下游關(guān)系。結(jié)合TET1及其共表達(dá)基因的KEGG-GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些共表達(dá)基因的功能主要集中于一些遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的信號通路，可確認(rèn)TET1在LUAD產(chǎn)生作用主要是通過遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究依托TCGA數(shù)據(jù)庫，對LUAD患者進(jìn)行大樣本數(shù)據(jù)分析和臨床資料對比分析，探討TET1基因表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響，可確定TET1基因可作為不同于傳統(tǒng)EGFR、TP53的LUAD驅(qū)動基因，對LUAD的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用。對TET1在LUAD的后續(xù)機(jī)制和相關(guān)共表達(dá)基因的研究，有利于臨床新型的LUAD預(yù)后評估分子標(biāo)志物和治療作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。