陳 平，劉 冉，黃萌萌，朱金魯，謝 芳，倪宏波，劉思國，張躍靈

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163000；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/動物細菌病創(chuàng)新團隊，黑龍江哈爾濱150069)

豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種革蘭氏陽性細菌，根據(jù)莢膜多糖組成和抗原性不同分為29 個血清型[1-2]，其中S.suis血清2 型(S.suisserotype 2，SS2)致病性最強[3-4]。SS2 不僅引起豬的腦膜炎、支氣管肺炎、敗血癥、關節(jié)炎、淋巴結炎以及死亡，還能引起人的化膿性關節(jié)炎、腦膜炎、心內膜炎和中毒性休克綜合癥等，并具有較高的致死率，是一種重要的人獸共患病原菌。因此，研究SS2 致病機制將有助于對其有效的防控[5-8]。

病原菌的免疫逃避系統(tǒng)是對其致病機制研究的重要方面。肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)表面蛋白StrH含有兩個N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(N-acetylglucosaminase，NAG)結構域，通過LPxTG 基序錨定在S.pneumoniae菌體表面。其兩個NAG 結構域的結構和功能相似，在水解補體蛋白糖基、減少補體沉積、逃避宿主免疫反應中起重要作用[9-10]，但目前尚無SS2 關于NAG 的報道。本研究通過氨基酸同源性比對、酶活性分析和基因缺失，發(fā)現(xiàn)了SS2 05ZYH33菌株的表面NAG，并鑒定了其活性，為研究其在SS2 致病性中的作用，以及SS2 逃避宿主免疫反應的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 SS2 05ZYH33 菌株為中國2005 年四川分離的流行菌株[3]，由蔡雪輝研究員惠贈；E.coliDH5α 和BL21 (DE3)感受態(tài)細胞分別購自上海唯地生物技術有限公司和TIANGEN 公司；pET28a 和pAT18 由本實驗室保存；LB 和THB 培養(yǎng)基購自美國BD 公司；LB (Amp)和LB (SPC)分別為添加100 μg/mL 氨芐青霉素(Amp)和100 μg/mL 壯觀霉素(SPC)的LB 培養(yǎng)基；THB (SPC)和THB(Erm)分別為添加100 μg/mL SPC 和5 μg/mL 紅霉素(Erm)的THB 培養(yǎng)基；4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-氨基葡萄糖苷(NP-GluNAc)試劑盒購自 Sigma 公司；PrimeSTAR Max DNA 聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR 產物純化試劑盒和DNA 膠回收試劑盒購自OMEGA 公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒和質粒小提試劑盒購自TIANGEN 公司；限制性內切酶和T4 DNA 連接酶購自Thermo Scientific 公司；Ni-NTA 親和樹脂和PD-10 脫鹽柱購自美國GE公司；超濾柱(10 ku-cutoff)購自美國Millipore 公司。

1.2 SS2 05ZYH33 全基因組推導氨基酸的序列分析、信息肽及引物的設計與合成 參照S.pneumoniaeStrH 的氨基酸序列對SS2 05ZYH33 全基因組推導氨基酸序列進行BLAST 分析，搜索SS2 05ZYH33 中與StrH 同源的氨基酸序列，采用ClustalX 和ESPript對兩種茵的同源氨基酸序列進行比對分析。轉化及構建突變體用的信息肽GE9(GNWGTWVEE)由哈爾濱博仕生物公司合成，純度97 %，溶于DMSO 配制成5 mmol/L 溶液。根據(jù)SS2 05ZYH33ssu05_ 0630的基因序列和pAT18 質粒的基因序列，采用Primer Premier 5 軟件設計引物： SsGH20NcoⅠF/SsGH20XhoⅠR 引物擴增ssu05_0630基因的預測結構域(Ss-GH20)基因序列；upF/upXhoⅠR/dnBamHⅠF/dnR 引物分別擴增ssu05_0630基因的上游序列UP 和下游序列DN；ErmF/ErmR 引物擴增pAT18 質粒中紅霉素抗性基因(erm)片段；SeqF/SeqR 引物鑒定陽性克隆和測序，全部引物由北京華大基因科技有限公司合成(表1)。

表1 實驗所用引物信息Table 1 Primers used in this study

1.3 SS2 05ZYH33 表面蛋白SSU05_0630 C 端SsGH20 結構域基因的克隆、表達和純化 提取SS2 05ZYH33 的基因組DNA 作為模板，采用表1 中引物SsGH20NcoⅠF/SsGH20XhoⅠR，PCR 擴增ssGH20基因。經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，克隆至經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET28a 質粒中，轉化E.coliDH5α，經(jīng)酶切和測序鑒定后，獲得含ssGH20基因的表達載體pET28a-ssGH20。將pET28a-ssGH20轉化E.coliBL21(DE3)，培養(yǎng)至OD600nm值為0.6 ～0.8 時加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，過夜誘導培養(yǎng)后離心收集菌體，超聲破碎后離心，上清用Ni-NTA 親和樹脂純化，采用梯度濃度的咪唑去除未結合的雜蛋白后經(jīng)250 mmol/L 咪唑洗脫。采用超濾柱對洗脫液濃縮，經(jīng)PD-10 脫鹽柱將緩沖液轉換為50 mmol/L 磷酸鈉(pH7.4)，通過SDS-PAGE 檢測重組蛋白的純化效果，凍存于-70 ℃。

1.4 ssGH20 NAG 活性的測定 以 1 mg/mL NP-GluNAc (溶于90 mmol/L pH4.7 檸檬酸緩沖液)為底物溶液，100 μL 體系中含有98 μL 底物溶液和2 μL 0.064 μmol/L SsGH20 結構域，37 ℃水浴10 min后加入200 μL 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液終止反應，測定底物溶液的OD405nm值。以NP-GluNAc 試劑盒提供的p-Nitrophenol (pNp)標準溶液繪制標準曲線，計算SsGH20 結構域的酶活力(U/mg)。1 單位酶活力定義為1 min 內水解生成1 μmol pNp 所需要的酶量。采用上述體系，在不同溫度(25 ℃～70 ℃)孵育后，測定底物溶液的OD405nm值，以最高活力為100 %計算相對酶活力，以測定SsGH20 結構域的最適酶活力溫度。以醋酸鈉、磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉和甘氨酸/氫氧化鈉配制0.1 mol/L pH3～pH11 的緩沖液替代檸檬酸緩沖液溶解底物，測定OD405nm值，以最高活力為100%計算相對酶活，以測定SsGH20 結構域的最適酶活力pH 值。以0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、 0.31 mmol/L、 0.625 mmol/L、 1.25 mmol/L、2.50 mmol/L 和5.00 mmol/L NP-GluNAc 為底物溶液，加入2 μL 0.064 μmol/L SsGH20 結構域多肽，37 ℃反應10 min，計算SsGH20 對不同濃度底物的反應初速度(V0)。采用GraphPad 非線性擬合，計算SsGH20 結構域對底物NP-GluNAc 的Km值，分析SsGH20 結構域的酶動力學。

1.5 SS2 05ZYH33ssu05_0630基因缺失株ssu05_0630Δ的構建 以SS2 05ZYH33 的基因組DNA 為模板，采用表1 中的upF/upXhoⅠR 和dnBamHⅠF/dnR 引物分別擴增ssu05_0630基因的上游序列UP 和下游序列DN；以pAT18 質粒為模板，采用表1 中的ErmF/ErmR 引物擴增erm+基因片段；將3 個片段回收后以摩爾比1∶1∶1 混合后經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切；酶切產物膠回收后作為模板，采用upF/dnR 引物， PCR 擴增獲得融合片段UP-erm-DN，與信息肽GE9 混勻后加入100 μL SS2 05ZYH33 菌液，混勻，37 ℃靜置培養(yǎng)2 h，涂布于THB (Erm)平板，過夜培養(yǎng)。挑取單菌落培養(yǎng)后，以表1 中的SeqF/SeqR 為引物，PCR 鑒定的陽性克隆經(jīng)測序鑒定后，獲得ssu05_0630基因缺失株ssu05_0630Δ。

1.6 SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ菌株的生長特性及全菌NAG 活性測定 將SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ菌株劃線接種于THB 平板，37 ℃，5 %CO2培養(yǎng)24 h， 期間觀察菌落形態(tài)； 將SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ菌株穩(wěn)定期菌液按1 %比例轉接新鮮THB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，5 % CO2靜置培養(yǎng)，每隔0.5 h 測定菌液OD600nm值，培養(yǎng)至12 h，繪制二者生長曲線；將SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ菌株培養(yǎng)至OD600nm值為0.6 時離心收集菌體，PBS洗滌兩次后，重懸于檸檬酸緩沖液至OD600nm值為1.0，將10 μL～50 μL 菌懸液與2 mg/mL NP-GluNAc底物溶液混合，加檸檬酸緩沖液補足100 μL 體系，分別孵育2 h 和12 h，測定OD405nm值，以檢測全菌的NAG 活性。

2 結 果

2.1 SS 2 05ZYH33 菌株中與StrH 同源的蛋白氨基酸序列分析 采用S.pneumoniae的StrH 氨基酸序列，通過BLAST 搜索其與SS2 05ZYH33 菌株的同源蛋白氨基酸序列，結果顯示該同源為氨基酸編碼的蛋白只有一個，為SSU05_0630。據(jù)報道，StrH 具有典型的信號肽和LPxTG 基序，使其錨定在菌體表面[11]，其含有兩個NAG 結構域，分別為GH20-1 和GH20-2 (根據(jù)NAG 所屬的糖苷水解酶家族GH20 命名)，兩者之間同源性51 % (圖1A)。結構域氨基酸序列分析顯示SSU05_0630 也含有典型的LPxTG 基序，表明它和StrH 一樣，也錨定于菌體表面。另外，SSU05_0630 也含有兩個糖苷水解酶結構域，但是不同于StrH，SSU05_0630 的這兩個糖苷水解酶結構域并不相同，分別屬于糖苷水解酶家族GH16 和GH20，分別命名為SsGH16 和SsGH20 (圖1A)。其中SsGH20 結構域與StrH 同源，與GH20-1 和GH20-2 同源性分別為60 %和52 %。序列比對顯示StrH 與SSU05_0630 的6 個關鍵催化位點[9](下方三角形指示)在SsGH20 結構域中均保守(圖1B)。提示SS2052YH33 菌株的SSVO5-0630 也可能具有NAG活性，且可能是SsGH20 結構域具有該NAG 活性。

2.2 SsGH20 結構域基因的克隆、表達和純化 以提取的05ZYH33 基因組為模板，以SsGH20NcoⅠF/SsGH20XhoⅠR 為引物，PCR 擴增SsGH20基因片段。結果顯示，擴增得到了約1 659 bp 的目的片段(編碼SSU05_0630 SsGH20 結構域的aa801～aa1353)，與預期相符(圖略)。將其克隆至pET28a，構建了含SsGH20結構域基因的表達載體pET28a-SsGH20。分別采用NcoⅠ和XhoⅠ單酶切鑒定結果顯示，獲得了約7 000 bp 的片段(圖2A)；采用NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切后獲得5 400 bp 和1 600 bp 兩個片段，與預期相符(圖2A)。經(jīng)測序鑒定，插入序列完全正確，表明正確構建了重組質粒pET28a-SsGH20。將其轉化E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG 誘導和Ni-NTA 親和樹脂純化后SDS-PAGE 檢測結果顯示，純化蛋白大小約62 ku，與預期相符(圖2B)。表明獲得了SsGH20結構域。

圖1 S.pneumoniae StrH 和SS2 05ZYH33 SSU05_0630 結構域分析(A)及氨基酸序列比對(B)Fig.1 Protein domain analysis of StrH and SSU05_0630 (A)and sequence alignment of GH20 domains (B)

2.3 SsGH20 結構域的NAG 活性的測定 采用NAG 底物NP-GluNAc 測定純化的SsGH20 結構域的NAG 活性，結果顯示SsGH20 結構域能夠水解NP-GluNAc，活力單位達到371 U/mg 蛋白，表明SsGH20 結構域具有NAG 活性。且其最適反應溫度為50 ℃(圖3A)，最適反應pH 為5.5 (圖3B)。酶動力學測定結果顯示SsGH20 結構域蛋白對NP-GluNAc 的Km 值為0.687 mmol/L (圖3C)。

2.4 SS2 05ZYH33ssu05_0630基因缺失株ssu05_0630Δ的構建與鑒定 通過PCR 擴增，分別獲得了ssu05_0630基因上游序列UP、下游序列DN和erm+基因序列；并通過酶切和融合PCR，獲得了這3 個片段的融合片段UP-erm-DN，大小均符合預期(圖4A、4B)。通過信息肽誘導該DNA 片段轉化SS2 05ZYH33 菌株并重組，挑取重組克隆，采用測序引物SeqF/SeqR，在SS2 05ZYH33 的轉化株中擴增獲得4 100 bp 的基因片段，而在SS2 05ZYH33 野生菌株(WT)中擴增獲得6 900 bp 的基因片段(圖4C)，通過對4 100 bp 的基因片段測序鑒定，結果顯示ssu05_0630基因被erm+基因替代，且上下游重組位置正確，表明獲得SS2 05ZYH33ssu05_0630基因缺失株ssu05_0630Δ。

圖2 重組質粒pET28a-SsGH20 的酶切鑒定(A)和重組SsGH20 純化效果的檢測(B)Fig.2 Restriction endonuclease analysis of pET28a-ssGH20 (A)and protein purification of SsGH20 (B)

圖3 SsGH20 結構域最適反應溫度(A)、pH(B)及Km 值(C)的測定結果Fig.3 Determination of optimal temperature (A), pH (B)and Km (C)of SsGH20

2.5 SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ菌株生長特性分析 將SS2 05ZYH33 和ssu05_0630菌株劃線于THB 平板，分別于16 h 、20 h 和24 h 觀察菌落特征，可見二者的菌落大小、形態(tài)無明顯差別；二者的生長曲線測定結果顯示， SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ菌株在THB 液體培養(yǎng)基中的生長速率基本一致(圖5)，表明ssu05_0630Δ基因缺失不影響SS2 05ZYH33 的生長特性。

圖4 相關基因片段的PCR 擴增(A)、融合片段的獲得(B)及ssu05_0630 基因缺失株的PCR 鑒定(C)Fig.4 Amplilation of gene fragments (A)for Ssuo5-0630 gene detetion, fusion of the fragments (B)and verification of gene deletion strain (C)by PCR

圖5 SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ 菌株的生長曲線測定Fig.5 Growth curve of SS2 05ZYH33 and ssu05_0630Δ strains

2.6 SS2 05ZYH33 和ssu05_0630Δ菌株NAG 活性的測定結果 采用全菌懸液測定兩株菌的NAG 活性。結果顯示，SS2 05ZYH33 菌株能夠水解底物NP-GluNAc，且水解的量與菌液量呈正比，并且隨著時間延長，NP-GluNAc 水解的量也顯著增加(圖6，WT)，表明SS2 05ZYH33 菌株存在具有NAG 活性的蛋白。而ssu05_0630Δ菌株不能夠水解NPGluNAc，即使作用時間延長到12 h，也無水解物的產生(圖6，ssu05_0630Δ)。綜合前面純化SsGH20 結構域活性的測定結果，表明SSU05_0630 是存在于SS2 05ZYH33 中的NAG，且是唯一具有NAG 活性的蛋白，不存在其它的同工酶。

圖6 SS2 05ZYH33 WT 和ssu05_0630Δ 菌株NAG 活性的測定結果Fig.6 Measurement of NAG activity of SS2 05ZYH33 WT and ssu05_0630Δ strains

3 討 論

很多病原菌表面存在多結構域的糖苷水解酶，這些糖苷水解酶含有糖基結合結構域和糖苷水解酶結構域，通過結合和水解宿主細胞表面的糖基，在粘附和逃避宿主免疫反應中發(fā)揮作用，被證實是一類重要的致病因子[11]。在鏈球菌屬中，S.pneumoniae表面的糖苷水解酶已經(jīng)受到重視并進行了較為深入的研究[12]，但是S.suis表面的糖苷水解酶至今鮮見報道。

S.pneumoniae表面糖苷水解酶StrH 含有兩個相同功能的NAG 結構域，被證明在逃避宿主免疫中發(fā)揮重要作用[13]。本研究顯示，SS2 05ZYH33 表面蛋白SSU05_0630 與StrH 同源，其SsGH20 結構域具有NAG 功能。而通過對缺失ssu05_0630基因突變株ssu05_0630Δ的構建，比較SS2 05ZYH33 菌株(WT)和ssu05_0630Δ菌株的生長特性及酶活性，表明ssu05_0630Δ不具有NAG 功能，SS2 05ZYH33 具有NAG 功能，且SsGH20 是其唯一具有NAG 活性的結構域。以NP-GluNAc 為底物時，SsGH20 的Km值為0.69 mmol/L，與S.pneumoniaStrH 的GH20-1(0.85 mmol/L)和GH20-2 (0.84 mmol/L)相當[14]。Ss-GH20 的最適作用條件為50 ℃，最適pH5.5。這些結果為研究SsGH20 在SS2 致病中的作用及SS2 逃避宿主免疫反應的機制奠定基礎。

不同于S.pneumoniae的StrH，SSU05_0630 含有另外一個不同糖苷水解酶家族的結構域SsGH16。根據(jù)CAZy 糖苷水解酶數(shù)據(jù)庫注釋(http://www.cazy.org/)，GH16 家族的糖苷水解酶包括內切半乳糖苷酶。據(jù)報道，在S.pneumoniae中，StrH 需要唾液酸酶NanA 和半乳糖苷酶BgaA 的協(xié)同作用，先由NanA 和BgaA 依次切除末端的唾液酸和半乳糖苷，StrH 才能以外切方式水解宿主復雜N-聚糖中的NAG，從而在減少C3 補體沉積，逃避宿主免疫反應中發(fā)揮作用[13-14]。本研究通過BLAST 分析后在SS2 05ZYH33 中未發(fā)現(xiàn)與NanA 和BgaA 同源的蛋白，而SsGH16 作為潛在的內切半乳糖苷酶，又與SsGH20 位于同一個蛋白中，其是否能夠與SsGH20協(xié)同作用，參與水解宿主免疫蛋白的復雜N-聚糖糖基，從而協(xié)助SS2 逃避宿主免疫反應，有待進一步發(fā)掘和研究。