劉文俊，陽佑天，易華東，鄧汝森，楊培潔，付新亮，黃運茂，田允波

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東廣州510225；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥工程學(xué)院，廣東佛山528000)

流感(Influenza)是由流感病毒(Influenza virus，IV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。IV屬于RNA 病毒的正粘病毒科，根據(jù)病毒的蛋白抗原性不同，可以分為A、B、C 三型[1]。其中A 型IV 的危害最大，該病毒可感染禽、豬、馬、犬、貓等動物，對我國養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了重大的威脅。同時，動物A 型IV 可跨宿主傳播感染人類，嚴(yán)重威脅了人類的健康安全[2]。因此如何快速有效的檢測動物中的A 型IV 引起越來越多人的關(guān)注。

目前，IV 的檢測方法主要有傳統(tǒng)的病毒分離方法和基于分子技術(shù)的RT-PCR 方法、熒光定量RT-PCR 方法、RT-LAMP 方法等，以及ELISA、免疫熒光、免疫膠體金試紙條等免疫學(xué)檢測方法[3]。其中熒光定量RT-PCR 方法因其較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，被作為動物A 型IV 的國標(biāo)檢測方法得到了廣泛的應(yīng)用[4]。但傳統(tǒng)的核酸檢測方法大多需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，專業(yè)的操作人員和較長的檢測等待時間，無法滿足快速診斷疾病的需求。因此，建立一種準(zhǔn)確、可靠、無需任何儀器設(shè)備的快速核酸檢測方法顯得尤為重要。伴隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，重組酶聚合酶擴增(RPA)檢測技術(shù)得到了快速的發(fā)展，該技術(shù)利用可分離DNA 雙鏈的重組酶蛋白、穩(wěn)定開放復(fù)合物的單鏈DNA 結(jié)合蛋白(SSB)以及DNA 聚合酶進行擴增。整個反應(yīng)過程在30 ℃～40 ℃的條件下進行，無需任何儀器設(shè)備，僅利用人體體溫10 min～20 min 內(nèi)即可完成檢測。具有快速、高效、穩(wěn)定的優(yōu)點，被譽為下一代檢測方法[5]。

本研究以動物A 型IV M 基因的保守區(qū)域為靶標(biāo)，并結(jié)合側(cè)吸層流膠體金試紙條技術(shù)(LFD)，建立了可在20 min 內(nèi)檢測動物A 型IV 的RPA-LFD 可視化檢測方法，為臨床快速診斷提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病 毒 A 型IV (H9N2、H6N6)、小鵝瘟病毒(GPV)、新城疫病毒(NDV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)及病毒核酸樣品(鴨肝炎病毒、H1 亞型、H5亞型、H7 亞型IV)均由廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室保存。50 份鴨咽拭子樣品采集自廣州市從化區(qū)某活禽交易市場。

1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA/DNA 提取試劑盒、primeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ExTaqDNA 聚合酶、DNA Marker、pMD18-T 載體、DH5α 感受態(tài)細胞和瓊脂糖均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自O(shè)MEGA 公司。TwistAmp nfo 試劑盒購自TwistDX 公司；一次性側(cè)流層析試紙條檢測裝置(LFD)購自杭州尤思達公司。

1.3 病毒RNA 的提取和M 基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)RNA/DNA 提取試劑盒說明書提取1.1 中各病毒RNA 或DNA，將抽提的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后保存于-80 ℃冰箱。根據(jù)NCBI A 型IV M 基因序列(AB972718)，設(shè)計引物P1：5'-ATGAGTCTTCTAAC CGAGGT-3'/P2：5'-CTCCAATCCTATGTTGACAA-3'，以禽H9N2 IV cDNA 為模板，擴增M 基因全長序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后膠回收純化，連接pMD18-T 載體，酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒使用Epoch 超微量分光光度計測定其濃度，并根據(jù)公式copies/μL=con.(ng/μL)×6.02×1023×10-9/660×bases 計算出重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，作為陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RPA 引物和探針的設(shè)計與篩選 根據(jù)NCBI 中登錄的近5 年不同基因型的流感病毒株序列，通過clustalW 軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比對選擇IV M 基因的相對保守區(qū)域，設(shè)計多對引物和探針，由上海生工股份有限公司合成及標(biāo)記。采用設(shè)計的引物和探針，按TwistAmp nfo 試劑盒說明書，在PCR 反應(yīng)管中添加Rehydration Buffer 29.5 μL，LF Probe 0.6 μL (10 μmol/L)，上下游引物各2.1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 12.2 μL，將所有組分混合后，加入預(yù)添加nfo 酶的PCR 反應(yīng)管中，混勻后加入1 μL 模板(H9N2 IV cDNA 為陽性模板，去離子水為陰性模板)，最后加入2.5 μL 醋酸鎂，在37 ℃條件下反應(yīng)25 min。通過2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，通過電泳條帶初步篩選出合適的引物和探針(表1，圖1)。將篩選出的上下游引物在NCBI blast數(shù)據(jù)庫進一步驗證和預(yù)測。

表1 RPA-LFD 方法引物及探針核苷酸序列Table 1 Recombinase polymerase amplification primers and probe used in this study

圖1 RPA 引物設(shè)計位點示意圖Fig.1 Map of RPA primer design sites

1.5 RPA-LFD 檢測方法的優(yōu)化 按照1.4 中所述，將篩選得到的引物和探針按TwistAmp nfo 試劑盒說明書推薦的反應(yīng)體系及條件進行反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物放置于一次性側(cè)吸層流檢測裝置中，按下裝置上的手柄，裝置底部的刀片會同時切開PCR 反應(yīng)管和裝有流動相液體的膠囊，被稀釋的反應(yīng)產(chǎn)物流到預(yù)先被FAM 抗體標(biāo)記質(zhì)控線和biotin 抗體標(biāo)記檢測線的試紙條上。由于下游引物與探針的擴增片段同時被FAM 和biotin 標(biāo)記，能與膠體金標(biāo)記的抗FAM 抗體形成三元復(fù)合物結(jié)合在含biotin 抗體的檢測線上，而未擴增的FAM 標(biāo)記探針形成不含biotin 的兩元復(fù)合物，結(jié)合在含F(xiàn)AM 抗體的質(zhì)控線上，檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：若為兩條帶即為陽性擴增，若僅有一條帶表明則為陰性[6]。正確的RPA 擴增產(chǎn)物進一步利用2 %瓊脂糖凝膠電泳，預(yù)期有兩條特異性條帶：其中一條為主帶，其大小與上下游引物之間的片段大小一致，210 bp；另一條帶是由核酶nfo 切割探針與下游引物共同擴增形成，其大小與探針和下游之前的片段大小一致，143 bp；陰性產(chǎn)物無特異性條帶。

同時，利用方陣試驗確定最佳反應(yīng)溫度(30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)和最佳反應(yīng)時間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)。

1.6 特異性試驗 采用本實驗建立的RPA-LFD 方法，對A 型IV 核酸(H1 亞型、H5 亞型、H6 亞型、H7 亞型和H9 亞型)以及GPV、NDV、DTMUV 和DHV 等家禽常見疫病病原進行特異性檢測，評價其特異性。

1.7 敏感性試驗 將構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋(106拷貝/μL～101拷貝/μL)后作為模板，利用本實驗建立的RPA-LFD 方法與基于引物P1/P2 的常規(guī)PCR 方法進行檢測，同時設(shè)無菌水為陰性對照。對兩種檢測方法的結(jié)果進行分析，評估本實驗建立的RPA-LFD 方法的敏感性。

1.8 臨床樣品檢測 按常規(guī)方法分別提取50 份鴨咽拭子樣品核酸反轉(zhuǎn)錄后作為模板，利用本實驗建立的RPA-LFD 方法和常規(guī)PCR 方法進行檢測，設(shè)H6 亞型IV 核酸為陽性對照，無菌水為陰性對照，比較兩種方法的檢測結(jié)果，計算二者的符合率。同時，根據(jù)A 型IV 基因保守區(qū)域設(shè)計HA 基因擴增引物：HA-F：5'-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGC AGGGG-3'/HA-R：5'-ATATCGTCTCGTATTAAGTAG AAACAAGGGTGTTTT-3'，以上述咽拭子樣品的cDNA 為模板，擴增并測序病毒的HA 片段。最終將采集的樣品經(jīng)雙抗處理后，離心取上清接種9 日齡雞胚，48 h 后收集存活雞胚的尿囊液，進行紅細胞凝集試驗和RT-PCR 方法鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 重組M 基因質(zhì)粒的構(gòu)建 以P1/P2 為引物進行PCR 擴增，結(jié)果顯示得到約1 000 bp 的條帶，與預(yù)期相符(圖略)。將目的片段連接PMD18-T 載體，經(jīng)Hind Ⅲ/BamHⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果顯示得到與目的片段大小相符的酶切產(chǎn)物(圖2)，表明重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18-M 正確構(gòu)建。經(jīng)測定質(zhì)粒濃度為217 ng/μL，經(jīng)計算其拷貝數(shù)為5.38×1010拷貝/μL。

2.2 RPA-LFD 方法的建立 按TwistAmp nfo 試劑盒方法篩選出的最佳引物及探針(表1)，并利用Blast 對引物進行進一步分析。結(jié)果顯示，RPA-LFD檢測結(jié)果陽性有2 條帶，陰性僅有1 條帶，符合預(yù)期的判定標(biāo)準(zhǔn)(圖3A)。正確的RPA 擴增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，結(jié)果顯示有兩條特異性條帶，其中一條主帶大小為210 bp，另一條帶大小為143 bp，陰性產(chǎn)物無特異性條帶，與預(yù)期一致(圖3B)。Blast 結(jié)果顯示此對引物理論上能夠與H1～H16/N1～N9 等多種IV 反應(yīng)。因此確定該對引物及探針為最佳。

圖2 重組M 基因質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant M gene plasmid

圖3 RPA-LFD 方法的建立Fig.3 Establishment of RPA-LFD detection method

2.3 RPA-LFD 最佳反應(yīng)條件的確定 進一步利用方陣試驗確定最佳反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間，結(jié)果顯示該檢測方法可以在30 ℃～40 ℃正常進行，其中35 ℃的檢測條帶顏色最明顯(圖4A)。由于35 ℃與人體表溫度接近，適宜用手握持完成反應(yīng)，因此選擇35 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。在35 ℃條件下，10 min 左右即可呈現(xiàn)肉眼可辨別的條帶，但較為暗淡，條帶的亮度隨著時間的增加不斷增強(圖4B)，綜合各因素，選擇15 min 作為RPA 反應(yīng)的時間。

2.4 特異性試驗結(jié)果 為評估RPA-LFD 檢測方法的特異性，采用確定的最佳反應(yīng)條件，以A 型IV核酸(H1 亞型、H5 亞型、H6 亞型、H7 亞型和H9亞型IV)以及GPV、NDV、DTMUV 和DHV 等家禽常見疫病病原核酸為模板進行RPA-LFD 檢測。結(jié)果顯示，除各A 型IV 均為陽性外，其余病原檢測結(jié)果均為陰性(圖5)，表明所建立的RPA-LFD 檢測方法具有較強的特異性。

圖4 RPA-LFD 擴增條件的確定Fig.4 Determination of RPA-LFD amplification condition

圖5 RPA-LFD 特異性分析Fig.5 Specific analysis of RPA-LFD

2.5 敏感性試驗結(jié)果 以10 倍倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(106拷貝/μL～101拷貝/μL)為模板，分別采用建立的RPA-LFD 方法和常規(guī)PCR 方法進行檢測。結(jié)果顯示RPA-LFD 方法的檢測下限為10 拷貝/μL，常規(guī)PCR 方法的檢測下限為103拷貝/μL，RPALFD 方法比常規(guī)PCR 方法敏感性高約100 倍(圖6)。表明該RPA-LFD 方法敏感性較高。

圖6 RPA-LFD 敏感性的比較Fig.6 Comparison of the RPA-LFD sensitivity

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果 將50 份采集的鴨咽拭子樣品提取核酸并反轉(zhuǎn)錄后，按本實驗建立的RPALFD 方法以及常規(guī)PCR 方法分別進行檢測，結(jié)果顯示兩種方法均檢測到3 份陽性樣品，其余47 份樣品均為陰性，符合率為100 %。陽性樣品HA 基因經(jīng)PCR 擴增后測序，結(jié)果顯示3 份陽性樣品均為H6亞型低致病IV，與最終的病毒分離鑒定結(jié)果相一致。表明本研究建立的RPA-LFD 檢測方法準(zhǔn)確性高，可用于臨床檢測。

3 討 論

A 型IV 因其宿主廣泛，可以感染人、家禽、豬、馬以及伴侶動物，且基因亞型眾多變異迅速，被全世界廣泛關(guān)注[7]。根據(jù)A 型流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)這兩種主要病毒抗原的特性可分為多個亞型。野生水禽被認為是A 型H1～H16 和N1～N9 IV 的主要儲存庫，近年來，在蝙蝠中也有H17N10 和H18N11 等亞型病毒分離的報道[1,8]。如何快速準(zhǔn)確的檢測IV 是疾病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本實驗建立的動物A 型IV RPA-LFD 快速檢測方法，在35 ℃等溫條件下20 min 內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，整個檢測過程不需要大型的儀器設(shè)備，結(jié)果可通過肉眼直接辨別。其特異性和敏感性均良好。與快速簡易的RNA 提取試劑盒相搭配，可以在現(xiàn)地完成疾病的診斷和初步篩查。RPA 技術(shù)不但具有快速、高效、便捷的特點，且具備非常高的穩(wěn)定性，重組酶凍干粉放入搭配的儲存管中，可以在室溫保存長達3 周[9]。目前，RPA 檢測方法被越來越多學(xué)者所關(guān)注，并建立了多種疫病的該檢測方法[7,10-11]。雖然RPA 檢測方法具有較多的優(yōu)勢，但值得注意的是RPA 檢測方法的引物目前并沒有合適的設(shè)計軟件，也沒有明確的設(shè)計原則，僅有試劑盒生產(chǎn)廠家的簡單指導(dǎo)意見。RPA 引物的長度要求在30 個堿基以上，探針的長度要求在48 個堿基以上，較難避免引物二級結(jié)構(gòu)的形成。同時，RPA-LFD 檢測方法引物設(shè)計要盡量避免探針和下游引物發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致的假陽性[12]。在本實驗過程中，設(shè)計的多組引物均出現(xiàn)不能正常反應(yīng)或者假陽性的情況。一般需要設(shè)計多組引物進行篩選，以獲得較佳的引物組合。

本實驗利用RPA 技術(shù)建立了一種等溫、快速、可視化的動物A 型IV RPA-LFD 檢測方法，并對該方法進行驗證。利用該方法對50 份臨床樣品進行檢測，結(jié)果與PCR 及病毒分離結(jié)果一致。該方法不依賴任何儀器設(shè)備，可為動物A 型IV 的現(xiàn)地快速檢測、流行病學(xué)研究提供參考。