王淑娟，王東方，趙月龍，謝彩華，趙雪麗，馬震原，王華俊，楊朋霞，閆若潛

(1.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州450008；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002)

塞內(nèi)卡病毒病是近年來(lái)傳入我國(guó)的一種動(dòng)物傳染病，可以引起豬鼻鏡及蹄冠處出現(xiàn)水皰、潰爛創(chuàng)面，偶見(jiàn)發(fā)燒及腹瀉，出生1 d～3 d 的新生仔豬死亡率可達(dá)30 %～70 %[3]，給養(yǎng)豬行業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒病由塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)引起，SVA 屬于小RNA 病毒科塞內(nèi)卡病毒屬[1]，其與小RNA 病毒科、心病毒屬病毒遺傳關(guān)系相近[2]。

SVA 感染豬后引起的臨床癥狀與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎等難以區(qū)分，僅憑借臨床癥狀和病理變化給該病診斷帶來(lái)了一定的困難。因此建立一種快速、特異、敏感檢測(cè)SVA 的方法勢(shì)在必行。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測(cè)SVA 核酸的方法。Bracht 等建立了SVA 的SYBR Green 熒光定量PCR檢測(cè)方法，敏感性和重復(fù)性較好[3]；Resende 等建立了檢測(cè)SVA 的原位雜交方法，可以從不同組織中檢出SVA，但其檢測(cè)周期較長(zhǎng)[4]；Feronato 等建立了檢測(cè)SVA 的套式PCR 方法，但其需要兩輪PCR 擴(kuò)增，最后還需電泳檢測(cè)[5]；樊曉旭等建立了塞尼卡谷病毒TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)方法，有較好的特異性和重復(fù)性[6]；林彥星等建立了SVA 的反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-RPA)快速檢測(cè)方法[7]。本研究以SVA 的3D 基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物和1 條MGB 探針，建立了SVA 熒光定量RT-PCR (FQ-PCR)檢測(cè)方法，為SVA 提供快速、敏感、特異的臨床檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒基因和樣品 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)VR2332 經(jīng)典株、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)CV777 株、豬口蹄疫病毒(FMDV)及SVA cDNA，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型2b (PCV2b)亞型病毒株、豬偽狂犬病毒(PRV)Bartha-K61 株DNA 均由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室制備保存。28 份疑似SVA 感染病料樣品(水泡液拭子、水皰皮、淋巴結(jié)等)由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 KingFisher 全自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit 購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；ExTaqDNA聚合酶、 Rnase Inhibitor、 DL2000 DNA Marker、DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小量純化試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、pGEM-T easy 載體均購(gòu)自Promega 公司。

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以SVA cDNA 為模板，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的SVA 常規(guī)PCR 方法擴(kuò)增3D 基因，克隆至pGEM-T Easy 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，PCR 鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定其OD260nm和OD280nm值，參考Kim 等的方法計(jì)算其拷貝數(shù)[8]，將其稀釋至1.04×108拷貝/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆?，作為SVA 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank 登錄的SVA 序列(KT321458.1)，應(yīng)用PrimerExpress 3.0.1 分析軟件，分別設(shè)計(jì)針對(duì)SVA 3D 基因的特異性引物(P1： 5'-TGCAYCCCTTYGCTGACT-3'/P2：5'-CCATCTTGCCTGCAGGTACTC-3')和TaqMan 探針(Probe-P3：5'-FAM-CGGTGCCGTACCGAG-MGB-3')，探針5' 端標(biāo)記為FAM。引物和探針均由Invitrogen公司合成。

1.5 反應(yīng)條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 選擇1.04×106拷貝/μL SVA 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，P1/P2為引物，采用矩陣法分別對(duì)引物濃度(0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L)， 探針 Probe-P3 濃度(0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L)，退火溫度(55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃和62 ℃)，體系(20 μL 和25 μL)進(jìn)行優(yōu)化。

將SVA 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋?zhuān)么_定的最佳反應(yīng)體系和條件進(jìn)行FQ-PCR 擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)3 次。以起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，Ct 值為Y 軸，建立SVA FQ-PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.6 特異性試驗(yàn) 按照確定的最佳反應(yīng)條件，對(duì)FMDV、PRRSV、PEDV cDNA，以及PCV2、PRV的總DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以SVA cDNA 為陽(yáng)性對(duì)照，BHK-21 細(xì)胞為陰性對(duì)照，評(píng)估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將SVA 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋(1.04 拷貝/μL～1.04×106拷貝/μL)后，利用本研究建立的FQ-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的SVA RT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 以3 個(gè)不同濃度(1.04×104拷貝/μL～1.04×106拷貝/μL)的SVA 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，利用本研究建立的FQ-PCR 方法進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；同時(shí)將該3 個(gè)不同濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分成3 個(gè)批次進(jìn)行FQ-PCR，評(píng)估該方法的批間重復(fù)性，以驗(yàn)證本研究建立的SVA FQ-PCR 方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣品檢測(cè) 利用本研究建立的SVA FQ-PCR 方法對(duì)28 份臨床疑似SVA 感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中，水泡液拭子直接取浸泡上清，水皰皮淋巴結(jié)采用組織研磨儀處理后取上清，利用全自動(dòng)核酸儀提取各處理上清的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)以SVA cDNA 為陽(yáng)性對(duì)照。以BHK-21 細(xì)胞為陰性對(duì)照。FQ-PCR 為陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物由寶生物工程(大連)有限公司純化及測(cè)序，同時(shí)與本實(shí)驗(yàn)室建立的SVA RT-PCR 方法檢測(cè)結(jié)果和測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 SVA cNDA 經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得460 bp 目的片段，與預(yù)期相符(圖1)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序，結(jié)果顯示為SVA 3D 基因片段，重組質(zhì)粒濃度為37.67 ng/μL，經(jīng)計(jì)算其拷貝數(shù)為1.04×1010拷貝/μL。

2.2 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)優(yōu)化，P1/P2 引物濃度為0.5 μmol/L，Probe-P3 探針濃度為0.25 μmol/L 時(shí)擴(kuò)增效率較穩(wěn)定，且最大程度節(jié)約成本。反應(yīng)體系確定為25 μL：10×ExTaq緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，P1、P2(20 μmol/L)各0.6 μL，Probe-P3 (20 μmol/L)為0.3 μL，5U/μL ExTaq酶0.25 μL，模板2 μL，補(bǔ)足去離子水至25 μL。最佳反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照無(wú)特異的擴(kuò)增曲線(xiàn)，且Ct 值>38.0 或無(wú)，陽(yáng)性對(duì)照的Ct 值應(yīng)≤25.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，判定檢測(cè)結(jié)果成立。在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，若樣品檢測(cè)結(jié)果Ct 值≤35.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，判定為陽(yáng)性；Ct 值>38.0 或無(wú)，且無(wú)特異的擴(kuò)增曲線(xiàn)，則判定為陰性；35.0

圖1 SVA 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的PCR 鑒定Fig.1 The identification of SVA stand plasmid by PCR

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 利用不同濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)3 次重復(fù)試驗(yàn)所得平均值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在1.04×101拷貝/μL～1.04×106拷貝/μL 范圍內(nèi)，其與Ct 值有很好的線(xiàn)性關(guān)系(圖2)，所獲得相關(guān)系數(shù)為0.998，斜率為-3.751，截距為41.00，得出拷貝數(shù)(X)與Ct 值(Y)之間的線(xiàn)性關(guān)系表達(dá)式：Y =-3.751×logX+41.00。

圖2 SVA FQ-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 The standard curve for SVA FQ-PCR

2.4 特異性試驗(yàn) 利用本研究建立的方法對(duì)SVA cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，而對(duì)FMDV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV 和正常BHK-21 細(xì)胞的核酸模板擴(kuò)增未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖3)。表明該方法特異性良好。

圖3 SVA FQ-PCR 方法的特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test for SVA FQ-PCR

2.5 敏感性試驗(yàn) 分別以各個(gè)稀釋度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行FQ-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示對(duì)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最小檢出量為1.04×101拷貝/μL，而常規(guī)PCR 最小檢出量為1.04×102拷貝/μL (圖4)，表明本研究建立的FQ-PCR 方法敏感性較高。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 將不同濃度的重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行FQ-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)在1.06 %～1.41 %，批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)在2.85 %～3.66 %。批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于4 %(表1)。表明建立的方法擴(kuò)增效率穩(wěn)定，重復(fù)性好。

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The sensitivity tests of the FQ-PCR (A)and the conventional PCR (B)

2.7 臨床樣品檢測(cè) 利用建立的SVA FQ-PCR 方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與本實(shí)驗(yàn)室建立的SVA RT-PCR 檢測(cè)方法和測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，SVA FQ-PCR 檢出9 份陽(yáng)性樣品，SVA RT-PCR 檢出6 份陽(yáng)性樣品，二者符合率為89.3 %。對(duì)9 份陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果顯示9 份PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物均為SVA 基因片段，與GenBank 中登錄的9株SVA 基因序列同源性均高于97 %。表明本研究建立的SVA FQ-PCR 方法可以用于臨床樣品的檢測(cè)。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of reproducibility

3 討 論

SVA 最初命名為塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，2015 年國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)批準(zhǔn)將種名由“Seneca valley virus，SVV”改為“Senecavirus A，SVA”，其所在的屬命名為“塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus)”[9]。雖然現(xiàn)有資料顯示SVA 不具備FMDV 的危害性，且大多數(shù)成年豬感染后預(yù)后良好，未引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生后果和經(jīng)濟(jì)損失[7]。但SVA 感染的臨床癥狀類(lèi)似于口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎等其它幾種水泡性疾病的病毒感染，給該病的診斷帶來(lái)困難。

病毒分離是檢測(cè)病毒最可靠的方法，但該方法操作麻煩，檢測(cè)周期長(zhǎng)。病原核酸檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的方法，F(xiàn)Q-PCR 技術(shù)具有敏感性高、特異性好、操作簡(jiǎn)單快捷，給檢測(cè)工作帶來(lái)很大便利。FQ-PCR 技術(shù)分為染料法和探針?lè)▋煞N，Jamnikar 等對(duì)染料法和探針?lè)ㄟM(jìn)行了比較，認(rèn)為探針?lè)ㄓ糜诙勘萐YBR Green I 染料法更為準(zhǔn)確，且特異性更強(qiáng)[10]。本研究建立的SVA FQ-PCR 檢測(cè)方法采用了TaqMan MGB 探針，與傳統(tǒng)的TaqMan 探針相比，TaqMan MGB 探針縮短了探針的長(zhǎng)度，明顯提高了探針的Tm 值，也降低了探針的合成成本，TaqMan MGB 探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，其本身不產(chǎn)生熒光信號(hào)，降低了本底信號(hào)的強(qiáng)度，使擴(kuò)增結(jié)果更加特異、敏感[11]。

本研究以SVA 的3D 基因保守序列為模板設(shè)計(jì)引物和探針，并篩選出引物、探針的最佳組合和最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了SVA FQ-PCR 檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)PCV2、PRV 的DNA 和PRRSV、PEDV、FMDV 的cDNA，結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性較強(qiáng)。該方法所用的TaqMan MGB 探針，對(duì)SVA 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最小檢出量為1.04 拷貝/μL，樊曉旭等利用TaqMan 探針建立的SVA FQ-PCR 方法可以檢出2.8 拷貝/μL 的樣品[6]，證實(shí)了TaqMan MGB 探針比TaqMan 探針具有更高的敏感性，且敏感性均高于常規(guī)PCR 方法。該方法批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于4 %，表明建立的方法擴(kuò)增效率穩(wěn)定，重復(fù)性好。對(duì)28 份臨床疑似SVA 感染的樣品中檢測(cè)出了9 份陽(yáng)性樣品，敏感性高于本實(shí)驗(yàn)室建立的SVA RT-PCR 方法，且檢出的9 份陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后證明確為SVA 3D 基因片段。表明本研究所建立的方法適用于水泡液拭子、水皰皮、淋巴結(jié)等不同種類(lèi)樣品的快速檢測(cè)，為SVA 病的早期診斷及綜合防控提供了特異、敏感、快速的方法。