鐵宇娟，劉陶林，蔡 卉，王東陽，劉志平，田麗紅

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

β-防御素(Beta-defensin，DEFB)是哺乳動物體內(nèi)一類重要的抗菌肽，廣泛分布于粘膜上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，是機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫的重要組成部分[1]。由于DEFB具有廣譜的抗微生物活性、細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)等作用，被認(rèn)為具備成為抗生素或抑菌活性藥的替代品的潛力藥物[2]。DEFB的抑菌作用與其獨(dú)特的生物學(xué)結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系，其抑菌途徑主要可分為兩類：一類是DEFB作用于細(xì)菌膜或細(xì)胞壁。DEFB殺菌的經(jīng)典機(jī)制是“孔隙形成”理論[3]，即帶正電荷的抗菌肽連接帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜(脂多糖、磷壁酸或磷脂)，然后形成孔洞導(dǎo)致細(xì)菌分解，如DEFB hBD-3 通過與脂質(zhì)雙分子層的連接來抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而殺死細(xì)菌[4]；另一類是DEFB作用于細(xì)菌內(nèi)部。DEFB可以誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞凝集，通過吞噬細(xì)胞吞噬發(fā)揮抗菌活性[5]，或者DEFB進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)結(jié)合遺傳物質(zhì)并抑制其蛋白質(zhì)的形成[6]。

此外，DEFB還可以作為機(jī)體體內(nèi)免疫應(yīng)答的重要調(diào)控因子，通過多種方式參與宿主免疫防御，包括增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用，加快中性粒細(xì)胞激活補(bǔ)體，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(Dentritic cells，DC)和促進(jìn)T細(xì)胞成熟等[7]。近年來的研究顯示[8-9]，DEFB參與人的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及男性生殖功能調(diào)節(jié)等作用，在牛和豬的抑菌、免疫調(diào)節(jié)及對雄性精子活性保護(hù)等方面發(fā)揮重要作用[10-11]，與哺乳動物機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答密切相關(guān)，但有關(guān)藍(lán)狐DEFB的研究在國內(nèi)外均未見相關(guān)報(bào)道。藍(lán)狐作為我國重要的特種毛皮經(jīng)濟(jì)動物[12]，養(yǎng)殖量逐年上升，疾病預(yù)防和有效繁殖直接關(guān)系到養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，藍(lán)狐DEFB的相關(guān)研究對于藍(lán)狐細(xì)菌病防治和提高生殖性能均具有重要意義。為此，本研究對藍(lán)狐DEFB 1(Vulpes lagopusbeta-defensin 1，vBD1)基因進(jìn)行擴(kuò)增克隆，并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在此理論基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了vBD1 重組基因酵母真核表達(dá)體系，表達(dá)了vBD1 重組蛋白，并初步探究了其抑菌活性，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 藍(lán)狐腎臟樣本由哈爾濱華隆藍(lán)狐育種有限公司提供；畢赤酵母菌GS115 標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)；pPIC9K 載體、大腸桿菌DH5α 和TOP10 感受態(tài)細(xì)胞均由東北林業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；各培養(yǎng)基根據(jù)需要加入終濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素(Amp)。

限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ)和T4 DNA 連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；超純總RNA提取試劑盒購自百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScriptⅡQ RT SuperMix)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Amp、DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒(小量)提取試劑盒等均購自哈爾濱迅捷生物科技有限公司；胰蛋白胨、瓊脂糖、酵母粉和NaCl等均購自哈爾濱東山試劑生物技術(shù)有限公司；鼠抗His-Tag 單克隆抗體(MAb)等購自北京百奧萊博科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)購自哈爾濱市泰斯特生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中藍(lán)狐vBD1 基因序列(MH491013)和pPIC9K 載體信息，設(shè)計(jì)vBD1 基因的PCR 引物與載體引物(表1)。

表1 PCR 擴(kuò)增所用的引物信息Table 1 The primer sequences for PCR amplification

1.3 藍(lán)狐vBD1 基因的PCR 擴(kuò)增 采用超純總RNA 提取試劑盒提取藍(lán)狐腎臟樣本總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模，PCR 擴(kuò)增vBD1 基因，PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s、53 ℃30 s、72 ℃45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并由吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.4 vBD1 蛋白的生物信息學(xué)分析

1.4.1 vBD1 蛋白的理化性質(zhì)分析通過DNAMAN 8.0 將vBD1 基因序列翻譯成氨基酸序列，利用Antheprot 軟件對vBD1 蛋白進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)(氨基酸含量、質(zhì)量、等電點(diǎn)等)分析。應(yīng)用EXPASY 服務(wù)器(https://web.expasy.org/cgi-bin/)的Protparam、ProtScale分析工具對蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成及蛋白的親水性與疏水性進(jìn)行分析。

1.4.2 vBD1 蛋白的結(jié)構(gòu)分析利用在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/的SignalP、TMHMM program、NetPhos、NetNGlyc 和NetOGlyc、NetCTL 在線網(wǎng)站，采用默認(rèn)參數(shù)，選擇高嚴(yán)謹(jǐn)度搜索，分析VBD1 氨基酸的信號肽、蛋白的跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)以及T 細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。利用http://tools.immuneepitope.org/bcell/對可能存在的線性B 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析。利用在線軟件https://www.predictprotein.org/# 對二硫鍵數(shù)量進(jìn)行分析。同時(shí)利用在線軟件https://npsa-prabi.ibcpfr/cgibin/npsa_automaplpage=/NPSA/npsa_server.html和SWISS-MODELWorkspace 對蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.5 pPIC9K-vBD1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將1.3 中PCR 擴(kuò)增得到的vBD1 基因回收，將其克隆至pMD19-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-vBD1。用EcoRⅠ和NotⅠ將表達(dá)載體pPIC9K 和重組質(zhì)粒pMD19-T-vBD1 分別雙酶切，回收純化后，T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR 和雙酶切鑒定為陽性的重組菌由吉林省庫美生物科技有限公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-vBD1。

1.6 無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA 的線性化及純化回收 根據(jù)畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ將提取的無內(nèi)毒素質(zhì)粒pPIC9KVBD1 線性化，酶切條件為：37 ℃，4 h～6 h。再經(jīng)氯仿抽提法，提取線性化產(chǎn)物DNA，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及PCR 鑒定 采用電轉(zhuǎn)化方法分別將線性化質(zhì)粒DNA(pPIC9K-vBD1和pPIC9K)轉(zhuǎn)化至100 μL 新鮮制備的畢赤酵母GS115 感受態(tài)細(xì)胞中，再經(jīng)過高拷貝轉(zhuǎn)化子(G418抗性)的篩選以及Mut+(Methanol utilization plus)甲醇利用正常型轉(zhuǎn)化子的篩選，獲得畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子。將篩選的pPIC9K-vBD1 的His+Mut+高拷貝轉(zhuǎn)化子接種于YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)液體培養(yǎng)基，28 ℃250 r/min 培養(yǎng)16 h～20 h，對3份樣品(2 份pPIC9K-vBD1/GS115， 1 份pPIC9K/GS115 培養(yǎng)后，離心收集菌體，提取酵母基因組。再以針對vBD1 和pPIC9K 的兩對引物(表1)對每個(gè)樣品進(jìn)行PCR 鑒定。

1.8 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將1.7 中鑒定的陽性菌分別接種于10 mL BMGY (Buffer Minimal Glycerol-complex of Yeast)+Amp 酵母誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基中，28 ℃250 r/min 恒溫震蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.65～0.80，轉(zhuǎn)接至200 mL BMMY (Buffer Minimal complex of Yeast)酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基中，并加入終濃度為1 %的甲醇(甲醇每24 h 補(bǔ)充一次)。以28 ℃250 r/min 誘導(dǎo)48 h 開始，每隔24 h 收集10 mL菌液(至120 h 為止)，離心，取上清液，-80 ℃凍存。收集的部分上清液經(jīng)過12 h 凍干濃縮處理后，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 分析；并將含有重組表達(dá)蛋白vBD1 的誘導(dǎo)菌上清液經(jīng)鎳離子瓊脂糖蛋白純化柱純化，-80 ℃凍存。再以鼠抗His-Tag MAb (1∶4 000)為一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP (1∶1 000)為二抗，對純化的蛋白進(jìn)行western blot 鑒定。

1.9 重組蛋白的抑菌活性試驗(yàn) 分別取100 μL 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種于5 mL 的LB 培養(yǎng)基，37 ℃180 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.60～0.70。再以LB 培養(yǎng)基為底液，稀釋1.8 中純化的重組蛋白，分別依次接種0.5 mL 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液，使得重組蛋白終濃度分別為0、30 μg/mL、60 μg/mL 和120 μg/mL，37 ℃180 r/min 培養(yǎng)，分別于接種后的0、4 h、8 h、12 h 和16 h 取樣，以10倍遞進(jìn)稀釋，進(jìn)行CFU 平板法計(jì)數(shù)，分析重組蛋白的抑菌率。

2 結(jié) 果

2.1 vBD1 氨基酸序列的同源性比對分析 藍(lán)狐vBD1 基因的編碼氨基酸序列與NCBI 中其它11 個(gè)物種的DEFB1 氨基酸序列比對分析顯示，藍(lán)狐vBD1 蛋白氨基酸序列與犬的DEFB1 的相似度最高，僅有1 個(gè)氨基酸的差異。藍(lán)狐vBD1 與其它11 個(gè)物種的DEFB1 均具有6-4-9-6-0 的半胱氨酸(Cyc)間隔模式，并且氨基酸序列長度與其余物種保持一致。

2.2 vBD1 蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果 利用Antheprot 軟件對vBD1 推導(dǎo)氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測，結(jié)果顯示vBD1 蛋白為69 aa，分子質(zhì)量為7.715 ku，其中半胱氨酸(Cyc)、甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)含量相對較高，分別為10.14 %、11.59 %和17.39 %；丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、甲硫氨酸(Met)和谷氨酰胺(Gln)的含量相對較低，為2.89 %。利用ProtScale 對vBD1 蛋白的疏水性進(jìn)行預(yù)測(Windows size=9)，根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)，反之分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，結(jié)果顯示，vBD1蛋白總平均疏水性(GRAVY)為-0.490，其在第10 位的分值最高(3.656)，有最強(qiáng)疏水性；在第31 位的分值最低(-1.489)，有最強(qiáng)的親水性。主要疏水部位分布在aa5～aa18、aa21～aa28 和aa47～aa53；主要親水部位分布在aa29 ～aa39、aa41 ～aa44 和aa56 ～aa65。表明vBD1 屬于親水類蛋白。

2.3 vBD1 蛋白的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 利用predictprotein 對vBD1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，該蛋白具有信號肽，其二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中α-螺旋(Hh)占34.78 %(24 個(gè))，伸展鏈(Ee)占14.50 % (10 個(gè))，無規(guī)則卷曲(Cc)占50.72 % (35 個(gè))。根據(jù)kinasephos2 的預(yù)測分析顯示，vBD1 蛋白具有12 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為3 個(gè)絲氨酸(Ser)、5 個(gè)蘇氨酸(Thr)和4 個(gè)酪氨酸(Tyr)，潛力均大于50 %。vBD1 蛋白具有3 個(gè)二硫鍵，分別位于第37 和第66 位、第44 和第59 位和第49 和第67 位。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，vBD1 蛋白序列與PDB 數(shù)據(jù)庫中人類β-防御素1 (Human beta defensin 1，hBD1)2nlc.2A 模板序列相似性達(dá)63.89 % (圖1)。

圖1 藍(lán)狐vBD1 蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.1 Tertiary structure prediction analysis of vBD1 protein

2.4 pPIC9K-vBD1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定以藍(lán)狐腎臟樣本RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增出約200 bp 的目的基因片段(圖2)。vBD1 基因序列測定和同源性分析結(jié)果顯示該基因大小為226 bp，與預(yù)期的226 bp 大小相符，編碼69 個(gè)氨基酸，該基因與藍(lán)狐vBD1 基因(MH491013)的同源性為100 %，表明獲得了藍(lán)狐vBD1 基因。將該基因克隆至pPIC9K 載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K-vBD1，經(jīng)EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切后，結(jié)果顯示，產(chǎn)生9 000 bp 的載體條帶和200 bp左右的目的條帶(圖3)，表明重組質(zhì)粒pPIC9K-vBD1正確構(gòu)建。

圖2 vBD1 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.2 Amplification of vBD1 gene by PCR

圖3 pPIC9K-vBD1 的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Double enzyme digestion identification of pPIC9K-vBD1 by PCR

2.5 畢赤酵母His+Mut+高拷貝轉(zhuǎn)化子的PCR 鑒定對篩選出的3 株重組畢赤酵母菌基因組，以pPIC9K通用引物5'AOXⅠ-F/3'AOXⅠ-R 進(jìn)行PCR 鑒定結(jié)果顯示3 個(gè)樣本在約600 bp 存在明顯條帶；再以特異性引物5'AOXⅠ-F/vBD1-R 進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示pPIC9K-vBD1 轉(zhuǎn)化子樣本在約800 bp 出現(xiàn)特異性條帶，而pPIC9K 空載體對照在約600 bp 出現(xiàn)條帶(圖4)。表明目的基因vBD1 整合至酵母基因組。

2.6 重組vBD1 蛋白的表達(dá)及western blot 鑒定分別收集重組菌pPIC9K-vBD1/GS115 和pPIC9K/GS115 誘導(dǎo)48 h、72 h、96 h 和120 h 的上清液，凍干濃縮后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果顯示，出現(xiàn)分子量約為7 ku 的目的條帶，表明重組vBD1 蛋白在酵母菌中以分泌形式獲得表達(dá)(圖5)。并對凍干濃縮后的上清樣液進(jìn)行his 標(biāo)簽鎳柱純化后，獲得純度較高的重組蛋白，經(jīng)western blot 分析，結(jié)果顯示誘導(dǎo)48 h、72 h、96 h 和120 h 樣品均在約7 ku 處出現(xiàn)一條特異性抗體結(jié)合條帶，而pPIC9K/GS115 對照樣本在相應(yīng)位置處無此特異性條帶(圖6)，表明具有His 標(biāo)簽的目的蛋白獲得表達(dá)，且96 h 的表達(dá)量最高。

圖4 含有重組質(zhì)粒pPIC9K-vBD1 的畢赤酵母基因組的PCR 鑒定Fig.4 Identification of Pichia genome containing recombinant plasmid pPIC9K-vBD1 by PCR

圖5 重組vBD1 蛋白的Tricine-SDS-PAGE 分析Fig.5 Analysis of recombinant vBD1 protein by Tricine-SDS-PAGE

2.7 重組蛋白的抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果 將重組vBD1蛋白分別以不同終濃度與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，進(jìn)行CFU 法計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算抑菌率。結(jié)果顯示，終濃度為60 μg/mL和120 μg/mL 的重組蛋白對大腸桿菌的抑菌率分別為22.92 %和29.17 %，對金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為28.40 %和30.18 %，抑菌活性均在12 h 達(dá)到最佳；終濃度為30 μg/mL 的重組蛋白基本不具備抑菌活性(表2)。表明重組蛋白vBD1 具備一定的抑菌活性，但其抑菌效率并不高。

圖6 重組蛋白vBD1 的western blot 分析Fig.6 Analysis of recombinant protein vBD1 by western blot

表2 重組蛋白vBD1 的抑菌率Table 2 Antimicrobial rate analysis of recombinant protein vBD1

3 討 論

本研究通過重組載體真核誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了較高純度的藍(lán)狐vBD1 蛋白，采用生物信息學(xué)軟件對該蛋白的結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)等生物學(xué)信息進(jìn)行預(yù)測分析。盡管不同宿主間DEFB1 的氨基酸序列存在差異，卻大體上均保持著擁有約69 aa 的成熟肽序列，同時(shí)均擁有“6-4-9-6-0”的半胱氨酸的分布模式，提示不同宿主間的DEFB1 蛋白擁有著類似的空間結(jié)構(gòu)。蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖1)進(jìn)一步證實(shí)藍(lán)狐vBD1蛋白與人hBD1 蛋白具有很高相似度。此外，對藍(lán)狐vBD1 蛋白序列在線預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)藍(lán)狐vBD1蛋白存在著12 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，提示藍(lán)狐vBD1 蛋白可能會作為受體蛋白，與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白定位等過程有密切聯(lián)系。

CFU 抑菌活性顯示，藍(lán)狐vBD1 蛋白呈現(xiàn)較弱的抑菌活性，然而DEFB 家族作為哺乳動物體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子[7]，其在參與免疫調(diào)節(jié)過程中具有重要意義。hBD1 作為人體重要的抗菌肽之一，廣泛分布于肺臟、肝臟、腎臟以及外周血等組織器官中[13-14]，與藍(lán)狐vBD1 的分布情況相似。Lehmann等通過熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，正常腎組織與慢性細(xì)菌感染的腎組織中hBD1 的表達(dá)量并沒有發(fā)生較大波動，而hBD2 的表達(dá)量明顯上升[15]，提示hBD1 對外源細(xì)菌微生物的直接作用并不明顯。Bose 等的體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hBD1 能夠作為信號因子，其誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的快速溶解，提示其可能具有抑癌能力，并且推測在前列腺癌癥患者中，致癌基因PAX2 通過與hBD1 啟動子結(jié)合，從而抑制hBD1 的表達(dá)，引發(fā)前列腺癌[16]。Raschig 等通過電子顯微鏡檢測和免疫熒光法發(fā)現(xiàn)，hBD1 的抑菌過程中，能夠形成一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來包裹住細(xì)菌，從而抑制細(xì)菌的侵染性，但并不直接殺死細(xì)菌[17]，表明hBD1 的直接抑菌活性較低，與重組蛋白vBD1 的抑菌試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，推測hBD1 在參與免疫過程中的主要作用是通過識別病原微生物或病變組織細(xì)胞，附著或以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包裹抗原表面，進(jìn)而遞呈給吞噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而并不具備直接殺菌的能力。鑒于藍(lán)狐vBD1 與人hBD1 在氨基酸組成和蛋白三級結(jié)構(gòu)相似性較高，且vBD1 蛋白的抑菌率約為30 %，提示vBD1 的主要抑菌途徑是通過作用標(biāo)記病原微生物表面，誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，而達(dá)到抑菌作用。但藍(lán)狐vBD1 蛋白是否作為免疫因子在細(xì)胞間傳遞信號以及具體的抑菌機(jī)制等目前尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)采用更接近于真核細(xì)胞天然結(jié)構(gòu)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，首次獲得了藍(lán)狐vBD1 的體外表達(dá)，并對該蛋白的體外抑菌活性進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步探究藍(lán)狐vBD1 蛋白抑菌功能以及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。