王文靜，李 素，王競晗，仇華吉，肖書奇1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150069)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(CSF virus，CSFV)引起的豬的一種急性、烈性傳染病，其傳播快、致死率高，給我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列入須申報的動物疫病名錄，我國將其列為一類動物疫病。豬瘟臨床上以高熱、全身泛發(fā)性出血和免疫抑制為主要特征[1]。

自從泛素系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)以來，其在蛋白質(zhì)降解中的重要作用逐漸被揭示，許多研究已經(jīng)表明了泛素特異性肽酶(USP)的重要性。該家族的一個特殊成員是USP18 蛋白(也稱為UBP43)，在過去的幾十年中，已發(fā)現(xiàn)人的USP18 蛋白不僅是一種去泛素化酶，而且是一種有效的IFN 信號傳導(dǎo)抑制劑，且其發(fā)揮作用不依靠自身酶活性[2-3]。研究表明下調(diào)USP18 分子的表達導(dǎo)致STAT1 酪氨酸磷酸化作用延長，促進IFN 刺激基因(ISGs)的表達進而抑制丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的復(fù)制[4]；另有研究表明下調(diào)USP18 表達后可以激活Hepg2.2.15 細胞中的JAK/STAT 信號傳導(dǎo)途徑并增強IFN-α 的抗乙型肝炎病毒活性[5]。在單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)感染后，USP18 分子通過招募USP20去除K48 位連接的聚泛素鏈增強了STING 的穩(wěn)定性并促進IFN-I 的表達[6]。

由于USP18 分子在不同物種及針對不同病毒感染中發(fā)揮的作用差異較大，其作用機制也有所不同。本實驗室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，CSFV 感染SPF 豬后，宿主細胞中USP18 基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升?；诖?，本研究通過一系列實驗方法檢測豬源USP18 分子對CSFV 復(fù)制的影響，以期為抗CSFV 治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 CSFV 石門株(AF092448.2)、CSFV報告病毒(rCSFV-Fluc)[7]、仙臺病毒(SeV)、豬腎細胞(PK-15)、人胚腎細胞(HEK293T)均由本實驗室保存。胎牛血清(Sigma-Aldrich，12003C)、DMEM 培養(yǎng)基(Gibco，8115354)、pFUGW 和輔助質(zhì)粒(psPAX2、pMD2.G)均由Addgene 提供；pCMV-Myc 購自Clontech 公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自天根公司。

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Prime STARHS 聚合酶、SYBR Permix、TRIzol 裂解液均購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、核酸膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒均購自天根公司；NP-40 裂解液購自碧云天公司；CCK-8 試劑盒購自Dojindo 公司； X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑、X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑均購自Roche 公司；Amicon Ultra-15 超濾管購自Millipore 公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega 公司；鼠源抗GAPDH單克隆抗體(MAb)、鼠源抗EGFP MAb、鼠源抗Myc MAb、鼠源抗Flag Mab 均購自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 中USP18基因序列(NM_213826.1)設(shè)計引物：USP18-F：5'-ATGGG GCCCGGTCGGTTTGCACAACATTG-3'/USP18-R：5'-T CAGGACTCAGCCATCATGTAAAC-3'；pMyc-USP18-EcoRⅠ-F：5'-CGGAATTCGGATGGGCCCGGTCGGT TTGCACAACATTG-3'/pMyc-USP18-KpnⅠ-R：5'-GG GGTACCTCAGGTTTACATGATGGCTGAGTCC-3'；pFUGW-USP18-SfiⅠ(A)-F：5'-ACAGGCCATTACGGC CATGGGCCCGGTCGGTTTGCAC-3'/pFUGW-USP18-SfiⅠ(B)-R：5'-TACGGCCGAGGCGGCCTCAGGACT CAGCCATCATGTAAAC-3'，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 提取PK-15 細胞的RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，USP18-F/R為引物，PCR 擴增目的基因，將PCR 產(chǎn)物回收后與pMD18-T simple 載體連接。測序正確后，以該重組質(zhì)粒為模板，分別使用特異性引物pMyc-USP18-KpnⅠ-F/R 及pFUGW-USP18-SfiⅠ(A)-F/R 擴增后，經(jīng)酶切后分別插入到載體pFUGW 及pCMV 中構(gòu)建pFUGW-USP18 及pMyc-USP18 重組質(zhì)粒。構(gòu)建的重組質(zhì)粒由吉林省庫美生物科技有限公司測序鑒定。

1.4 CSFV 感染對USP18 基因轉(zhuǎn)錄影響的檢測基于本實驗室前期動物實驗基礎(chǔ)[8]，采集CSFV 感染和未感染組SPF 豬第1 d、3 d、5 d 的外周血，利用豬外周血單個核細胞(PBMC)分離試劑盒分離PBMCh 后，分別提取其RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過熒光定量PCR 檢測CSFV 感染前后USP18 基因在豬PBMCs 中的相對轉(zhuǎn)錄水平[9]；同時，采集CSFV感染豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等組織臟器，采用熒光定量PCR[9]檢測不同組織臟器中USP18 基因的轉(zhuǎn)錄水平。將CSFV 以MOI 為0.1 的劑量接種PK-15 細胞，分別在感染后不同時間(0、0.25 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)收集細胞及細胞培養(yǎng)上清，通過熒光定量PCR[9]檢測USP18基因在PK-15 細胞中的相對轉(zhuǎn)錄水平，并采用TaqMan 熒光定量PCR[10]檢測細胞培養(yǎng)上清中病毒基因組的拷貝數(shù)。

1.5 過表達USP18 對CSFV 復(fù)制影響的檢測 將HEK293T 細胞鋪于10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，待細胞匯合度達80 %左右時，采用X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑分別將重組質(zhì)粒pFGUW-USP18、輔助質(zhì)粒psPAX2 和pMD2.G 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞。同時，轉(zhuǎn)染pFGUW-EGFP 作為對照。48 h 后收集細胞培養(yǎng)上清(即為包裝的慢病毒)，將慢病毒經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾于Amicon Ultra-15 超濾管中10 倍濃縮后轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15 細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h 后通過熒光顯微鏡觀察細胞中的綠色熒光，將該細胞連續(xù)傳10 代，熒光顯微鏡觀察每代細胞均出現(xiàn)綠色熒光后，選取第10 代的PK-15 細胞裂解物，以鼠源抗EGFP MAb (1∶1 000)為一抗，IRDye800CW 羊抗鼠IgG (1 ∶10 000)為二抗，采用western blot 檢測目的蛋白的表達情況，獲得的穩(wěn)定表達USP18 和EGFP 的PK-15 細胞系，分別命名為PK-USP18 和PK-EGFP (對照)。并利用CCK-8 試劑盒檢測兩種細胞系的活力。將PK-USP18和PK-EGFP 細胞系分別以MOI 0.1 接種CSFV 石門毒及rCSFV-Rluc，24 h 后利用TaqMan 熒光定量PCR[10]檢測細胞中病毒基因組的拷貝數(shù)，采用間接免疫熒光(IFA)檢測CSFV 抗原[11]，利用Reed-Muench 法計算病毒滴度[12]；應(yīng)用雙熒光素酶檢測試劑盒的裂解液裂解細胞，離心后，在檢測白板中每孔中加入50 μL 裂解產(chǎn)物上清液及70 μL 海腎熒光素酶(Rluc)檢測底物，混勻后，將白板放入多功能聚焦式熒光分析儀中讀取熒光值，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測USP18 分子對rCSFV-RIuc 復(fù)制的影響。

1.6 下調(diào)USP18 分子表達后對CSFV 復(fù)制影響的檢測 針對豬源USP18 基因，設(shè)計并由上海吉瑪公司合成了3 條特異性的干擾RNA 分子(siUSP18s)及1 條無關(guān)干擾分子(siNC)，分別為：siUSP18-18：5'-GGUCGGUUUGCACAACAUUTT-3'；siUSP18-370：5'-GGUGCAACCCAUGGAACUUTT-3'；siUSP18-1060：5'-CCAGUGUACUUAUGGAAAUTT-3'；siNC：5'-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。 待24 孔板中的PK-15 細胞匯合度約為60 %時，分別將120 nmol/L siUSP18s、siNC 和X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑與DMEM 配制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將其轉(zhuǎn)染PK-15 細胞。37 ℃培養(yǎng)36 h 后，分別以MOI 0.1 接種CSFV 石門株及rCSFV-Rluc，感染48h 后，分別收集培養(yǎng)上清及細胞，培養(yǎng)上清分別采用1.5 的方法檢測病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度；收集的細胞利用1.4、1.5的方法分別檢測轉(zhuǎn)染兩種干擾分子的細胞的活力及其USP18 基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和USP18 的蛋白表達。

1.7 USP18 分子對I 型干擾素信號通路影響的檢測通過計算轉(zhuǎn)染細胞中螢火蟲熒光素酶(Fluc)和Rluc的比值來分析USP18 分子對IFN-β、ISRE 及NF-κB啟動子活性的影響。將重組質(zhì)粒pIFN-β-Luc+pSV40-Rluc+pCMV-USP18/pCMV-Myc)(IFN-β 組)；pISRELuc+pSV40-Rluc+pCMV-USP18/pCMV-Myc)(ISRE 組)；pNF-κB-Luc+pSV40-Rluc+pCMV-USP18/pCMV-Myc)(NF-κB 組)分別轉(zhuǎn)染PK-15 細胞；每組設(shè)6 個重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h 后，每個轉(zhuǎn)染組的3 個重復(fù)孔接種SeV，另外3 個重復(fù)孔作為未接種病毒對照，接種病毒24 h 后收集細胞，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測Fluc 熒光值及Rluc 熒光值，分析過表達豬源USP18 分子后對IFN-β、ISRE 及NF-κB 通路的影響。轉(zhuǎn)染pIFN-β-Luc+pSV40-Rluc+pCMV-USP18(0、0.1 μg/孔、0.2μg/孔、0.4 μg/孔)及空載體pCMVMyc (0.4 μg/孔、0.3 μg/孔、0.2 μg/孔、0)檢測過表達不同劑量的USP18 蛋白對IFN-β 啟動子活性的影響。之后基于1.6 RNA 干擾試驗將PK-15 細胞中USP18基因下調(diào)表達后，利用本實驗室已有的熒光定量PCR 檢測IFN 下游ISGs 分子Mx1、GBP1 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，進一步研究USP18 分子對IFN-I信號通路的影響。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究中每組數(shù)據(jù)設(shè)3 個重復(fù)，每組實驗重復(fù)3 次；采用Graphpad Prism5 軟件作圖，應(yīng)用SPSS 軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行Student 氏t檢驗或方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 CSFV 感染對USP18 基因轉(zhuǎn)錄的影響 利用熒光定量PCR 分別檢測CSFV 感染前和感染后不同時間豬PBMC 中USP18基因的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示感染CSFV 后1 d USP18 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，隨后逐漸降低(圖1A)。分別檢測感染及未感染CSFV的豬不同的組織器官，結(jié)果顯示USP18 在CSFV 主要的靶器官扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟及腎臟中的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p<0.01)(圖1B)。PK-15 細胞感染CSFV(MOI 0.1)后不同時間點收集上清和細胞檢測CSFV基因組拷貝數(shù)以及USP18基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與未接種病毒組(Mock)相比，CSFV 感染后細胞中病毒基因拷貝數(shù)逐漸升高(圖1C)。USP18基因轉(zhuǎn)錄水平在CSFV 感染后的前6 h 與Mock 無顯著差異，而感染24 h 后與Mock 相比其轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p<0.01)(圖1D)。表明CSFV 感染可以促進USP18基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖1 CSFV 感染對USP18 基因轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測結(jié)果Fig.1 Effects of CSFV infection on the transcription of USP18 gene

2.2 過表達USP18 蛋白對CSFV 復(fù)制的影響 利用倒置熒光顯微鏡及western blot 對PK-USP18、PK-EGFP 細胞系進行了鑒定。結(jié)果顯示，在倒置熒光顯微鏡下可見明顯的綠色熒光(圖2A)，western blot 可以檢測到USP18 分子特異性條帶(圖2B)，表明構(gòu)建的PK-USP18 細胞系可以穩(wěn)定表達USP18 蛋白。 細胞活力測定結(jié)果顯示， PK-USP18 與PK-EGFP 相比細胞的活力狀態(tài)無明顯差異(圖2C)。對PK-USP18 細胞及PK-EGFP 對照細胞分別接種CSFV 石門株及重組病毒rCSFV-Rluc，檢測上清中病毒基因組拷貝數(shù)及病毒滴度，結(jié)果顯示過表達USP18 蛋白后，病毒基因組拷貝數(shù)(p<0.01)(圖2D～2E)及病毒滴度(p<0.01)(圖2F)與對照組相比均顯著上升。表明過表達USP18 蛋白可以顯著促進CSFV 的復(fù)制。

圖2 過表達USP18 蛋白對CSFV 復(fù)制影響的檢測結(jié)果Fig.2 The effects of overexpression of USP18 on CSFV replication

2.3 下調(diào)USP18 蛋白的表達對CSFV 復(fù)制的影響PK-15 細胞轉(zhuǎn)染USP18 干擾分子(siUSP18s)及無關(guān)干擾分子(siNC)48 h 后，分別收集細胞及上清，利用分別檢測轉(zhuǎn)染兩種干擾分子后的細胞活力及其中USP18基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平；檢測上清中病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染兩組干擾分子的細胞活力無明顯差異(圖3A)，與轉(zhuǎn)染對照分子的細胞相比，轉(zhuǎn)染siUSP18s 干擾分子細胞的USP18 基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達量(圖3B～3C)、CSFV 基因組拷貝數(shù)及病毒滴度均有顯著下降(圖3D～3F)。表明下調(diào)USP18 蛋白表達可以抑制CSFV的復(fù)制。

圖3 下調(diào)USP18 對CSFV 復(fù)制影響的檢測結(jié)果Fig.3 The effects of knockdown of USP18 expression on the CSFV replication

2.4 豬源USP18 分子對I 型干擾素信號通路的影響 通過雙熒光素酶報告試驗檢測USP18 分子對IFN-β、ISRE 和NF-κB 啟動子活性的影響。結(jié)果顯示，與空載體對照組相比，在不加SeV 刺激的情況下過表達USP18 蛋白可以輕微地抑制IFN-β、ISRE和NF-κB 的啟動子活性；而在SeV 刺激下USP18蛋白可以較明顯地抑制IFN-β、NF-κB 和ISRE 的啟動子活性(p<0.01)(圖4A～4C)；轉(zhuǎn)染不同劑量的USP18 蛋白可以呈劑量依賴性的抑制IFN-β 啟動子活性(圖4D)。同時，檢測了IFN-I 通路下游的ISGs分子Mx1、GBP1 等基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，下調(diào)USP18 基因后促進IFN-I 下游分子的表達(p<0.01)(圖4E～4G)。以上結(jié)果表明USP18 蛋白通過抑制IFN-I 通路從而促進CSFV 的復(fù)制。

圖4 檢測USP18 分子對I 型干擾素通路影響的檢測結(jié)果Fig.4 The effects of USP18 on I interferon signaling pathway

3 討 論

病毒感染可以激活宿主的天然免疫系統(tǒng)，觸發(fā)宿主細胞中的一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，分泌IFN-I，進而產(chǎn)生ISGs 引起宿主抗病毒的免疫應(yīng)答[13]；同時，病毒也進化出了一系列策略來抵抗宿主IFN 的產(chǎn)生以及ISGs 的活性。CSFV 通過多種機制拮抗宿主先天免疫，如利用Npro 靶向IRF3 和IRF7 來阻斷IFN-I 的產(chǎn)生[14]，利用NS5A 拮抗GBP1 的抗病毒活性[9]，利用C 蛋白與HB 相互作用抑制RIG-I 介導(dǎo)的IFN-β 信號傳導(dǎo)[11]。因此，對病毒和宿主先天免疫相互拮抗作用的了解將有助于研發(fā)抗病毒靶標。明確CSFV 與宿主之間的相互作用將豐富對CSFV 致病機制的理解，為創(chuàng)新CSF 防控新策略提供參考依據(jù)，例如基于開發(fā)新的抗病毒藥物、快速減毒、構(gòu)建有效高產(chǎn)疫苗株和CSF 抗性轉(zhuǎn)基因豬[15]。SeV 是模擬dsRNA 誘導(dǎo)天然免疫信號通路常用的模式病毒[16]，由于PK-15 細胞難以轉(zhuǎn)染，所以本研究采用HEK293T細胞轉(zhuǎn)染來研究過表達USP18 對天然免疫報告系統(tǒng)的影響，應(yīng)用SeV 作為IFN-I 信號通路激活劑。

本研究基于本實驗室前期動物實驗基礎(chǔ)[8]，并在SPF 豬接種CSFV 后對PBMC 細胞進行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了宿主分子USP18 在感染CSFV 前后表達差異明顯?；诖?，本研究檢測了CSFV 感染SPF 豬后USP18 基因在不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示USP18 分子在脾臟和淋巴結(jié)等組織中的豐度較高，推測CSFV 與宿主的USP18 分子存在重要的相關(guān)性。通過上調(diào)及下調(diào)USP18 分子的表達證實其能夠促進CSFV 的復(fù)制。為了明確USP18 分子在CSFV 感染過程中的作用機制，本研究通過驗證USP18 分子對IFN-β、NF-κB 及IRSE 啟動子活性的影響，發(fā)現(xiàn)其對IFN-β 啟動子活性具有顯著的抑制作用，并進一步驗證了USP18 分子呈劑量依賴性的抑制IFN-β 的啟動子活性。通過對IFN-I 下游分子GBP1、Mx1 的檢測，佐證了USP18 分子能夠抑制IFN-I 信號通路。上述結(jié)果表明USP18 分子通過抑制IFN-I 信號通路正調(diào)控CSFV 的復(fù)制。

在PRRSV 的研究中，USP18 分子通過促進NF-κB 亞單位p65 的核轉(zhuǎn)位，以及抑制p50 的核轉(zhuǎn)位而發(fā)揮抗病毒作用[17]。本研究首次將豬源USP18引入到CSFV 的研究中，結(jié)果表明豬源USP18 分子通過抑制IFN-I 信號通路正調(diào)控CSFV 的感染。由于USP18 分子的功能是多方面的，相同的基因在不同物種中發(fā)揮的作用差異較大，而在同一物種中該基因在不同病毒中發(fā)揮的作用也不盡相同。此外，在CSFV 感染過程中豬源USP18 分子通過與病毒的何種蛋白以及I 型信號通路中的哪個分子相互作用進而發(fā)揮其調(diào)控信號通路的功能，還有待進一步的研究。