李梅

(山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033)

牽張成骨術(shù)起源于矯形外科，是一類內(nèi)源性的組織工程技術(shù)，既避免了供區(qū)創(chuàng)傷又可使軟組織同步延長(zhǎng)，廣泛應(yīng)用于臨床頜面骨矯形手術(shù)和骨缺損矯形手術(shù)，有創(chuàng)傷小、無需植骨、不發(fā)生排斥反應(yīng)、面部軟硬組織比例協(xié)調(diào)、避免二次手術(shù)等優(yōu)點(diǎn)。1992年?duì)繌埑晒羌夹g(shù)首次應(yīng)用于先天下頜畸形的治療，然而其存在治療周期長(zhǎng)、新生骨組織礦化水平較差等問題[1]。因此，促進(jìn)牽張間隙的新骨形成及礦化、縮短牽張后的固定期成為學(xué)者們研究的方向。骨組織的新陳代謝和新生作用受到神經(jīng)的支配。臂板蛋白3A是一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向性分子，是成骨細(xì)胞分泌的一種蛋白，具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生理活動(dòng)的作用，并可直接或間接調(diào)節(jié)骨骼的新生和改建。2017年1～5月，本研究觀察了臂板蛋白3A對(duì)兔下頜骨牽張成骨的成骨效應(yīng)的影響，以期為提高牽張間隙內(nèi)的成骨質(zhì)量、縮短牽張成骨治療周期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要器材 純種新西蘭大白兔20只，5～6月齡，體質(zhì)量2～3 kg，雌雄不限，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，由山東大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鈦合金內(nèi)置式牽張器及鈦合金螺絲，臂板蛋白3A，頜骨微動(dòng)力系統(tǒng)，iDXA，力學(xué)測(cè)試裝置。

1.2 下頜骨牽張成骨模型制作及臂板蛋白3A用法 對(duì)20只新西蘭大白兔行右側(cè)下頜骨牽張成骨術(shù)。術(shù)前實(shí)驗(yàn)兔禁水禁食8 h，稱重并記錄，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)。頭取側(cè)仰位，暴露左側(cè)下頜部，備皮，加用2%鹽酸利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉，消毒，鋪巾。于實(shí)驗(yàn)兔下頜角前方、下頜骨下緣下方1 cm暴露下頜骨，暴露頦孔及頦神經(jīng)；在下切牙后方0.5～1 cm處切開下頜骨上2/3，固定牽張器使其與骨面貼合；再切開下頜骨下緣1/3，使下頜骨完全離斷；充分止血后分層縫合創(chuàng)口，術(shù)后給予10%葡萄糖80 mL加160萬單位青霉素連續(xù)靜滴7 d。延遲期為6 d，于術(shù)后第7天開始牽張，牽張期連續(xù)10 d，每天10：00和20：00各牽張0.4 mm，至牽張結(jié)束時(shí)共延長(zhǎng)8 mm。將20只兔隨機(jī)分為A、B兩組，每組10只。A組為空白對(duì)照，模擬常規(guī)牽張成骨術(shù)后的組織再生過程。B組于牽張期第1、5、10天在牽張間隙內(nèi)注射臂板蛋白3A(500 μg/kg)。牽張過程結(jié)束后進(jìn)入固定期。20只兔全部存活，均出現(xiàn)偏頜，1只兔牽張器螺旋桿在延遲期內(nèi)埋入皮下，經(jīng)二次手術(shù)后重新暴露并固定。所有牽張器均固定穩(wěn)固、無松動(dòng)。牽張間隙處骨組織有明顯增厚，表面有軟組織附著。分別于固定期第2、6周，各組隨機(jī)處死5只動(dòng)物，取右側(cè)下頜骨標(biāo)本，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 下頜骨影像學(xué)檢查 獲得下頜骨標(biāo)本后采用X線檢查(50 kV，6 mA，0.06 s)，觀察下頜骨形態(tài)。所獲取的圖像信息通過DVD刻錄保存。

1.4 牽張區(qū)骨組織觀察 距牽張間隙約1 cm截取牽張區(qū)及相鄰的骨組織，標(biāo)本浸泡在4%的中性甲醛緩沖溶液中48 h固定，然后采用10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣4周，脫鈣期間每3 d更換1次EDTA溶液。脫鈣之后的組織經(jīng)過沖洗、梯度乙醇脫水及石蠟包埋后，沿著下頜骨的長(zhǎng)軸方向進(jìn)行組織切片，切片厚度為4 μm，不連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本制作6張切片，HE染色觀察。

1.5 骨小梁寬度(TNTB)、新生骨數(shù)量(NBV)測(cè)算 采用圖像分析軟件Image-Pro Puls6.0進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量分析。6張切片每張的牽張間隙內(nèi)隨機(jī)選擇20個(gè)新生骨小梁，在每個(gè)新生骨小梁上隨機(jī)測(cè)量5處骨小梁寬度，該骨小梁的寬度為所測(cè)量5處的均值，20個(gè)新生骨小梁寬度的均值即為該張切片的TNTB。對(duì)牽張間隙內(nèi)新生骨骼組織的面積進(jìn)行測(cè)定，包括皮質(zhì)區(qū)新生骨骨量(NBV1)和松質(zhì)區(qū)新生骨骨量(NBV2)，每個(gè)標(biāo)本均測(cè)量6張不連續(xù)切片，取均值。

1.6 成骨區(qū)骨密度(BMD)、骨礦物質(zhì)含量(BMC)檢測(cè) 使用iDXA設(shè)備，調(diào)節(jié)到高分辨率、小型動(dòng)物模式。用DXA掃描暫時(shí)浸泡于去離子水的下頜骨樣本，將成骨區(qū)域設(shè)定為興趣區(qū)，掃描后得到BMD和BMC。

1.7 成骨區(qū)生物力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 使用力學(xué)測(cè)試裝置對(duì)兩組下頜骨成骨區(qū)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。受力區(qū)域受到1 mm/min的連續(xù)擠壓，直到斷裂，繪制載荷變形曲線圖，并記錄成骨區(qū)最大載荷(成骨區(qū)能承受的最大力)、剛度(載荷變形曲線斜率)和總能量吸收(成骨區(qū)壓縮過程中吸收的總能量)。

2 結(jié)果

2.1 下頜骨X線檢查結(jié)果 去除牽張器后，僅有A組在固定期第2周處死的1只大白兔下頜骨骨斷端稍有活動(dòng)度，約1 mm。在固定期第2周，A組X線檢查顯示顯著的下頜骨斷開痕跡，在牽張間隙中隱約可見骨骼低密度影像學(xué)特征，骨皮質(zhì)無連續(xù)性(圖1A)；B組亦可見顯著的切開痕跡，下頜骨上部和下部邊緣的部分區(qū)域模糊顯示早期骨皮質(zhì)成骨特征，部分區(qū)域的骨密度與周圍正常骨質(zhì)接近，不易區(qū)分(圖1B)。在固定期第6周，A組X線檢查示骨切開斷端痕跡不清晰，下頜骨下緣區(qū)域形成早期皮質(zhì)骨，牽張間隙內(nèi)可見明顯的成骨影像(圖2A)；B組骨切開斷端密度與周圍正常骨皮質(zhì)基本一致，不易辨認(rèn)，牽張間隙內(nèi)新骨礦化程度較好，骨斷端完全愈合，下頜骨被延長(zhǎng)(圖2B)。

注：A為A組；B為B組。

圖1 牽張成骨固定期第2周時(shí)兩組下頜骨本X線影像

注：A為A組；B為B組。

圖2 牽張成骨固定期第6周時(shí)兩組下頜骨標(biāo)本X線影像

2.2 兩組牽張區(qū)骨組織形態(tài)變化 固定期第2周時(shí)，A組與牽張方向相同的骨細(xì)胞被拉長(zhǎng)，膠原纖維平行排列，可見新的較細(xì)的骨小梁結(jié)構(gòu)，表面覆蓋了大量的成骨細(xì)胞(圖3A)；B組有少量平行排列的膠原纖維組織，新生骨小梁內(nèi)可見小血管生成，部分區(qū)域可以觀察到骨小梁較為粗大，且骨小梁周圍分布著大量的成骨細(xì)胞(圖3B)。固定期第6周時(shí)，A組沿牽引方向生有較多的新生骨組織，髓腔中可以發(fā)現(xiàn)圓形基質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)部膠原纖維基本消失，可見骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖4A)；B組牽張區(qū)域內(nèi)有密集的骨小梁排布，且骨小梁較粗大，可見成熟的骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖4B)。

注：A為A組；B為B組。

圖3 牽張成骨固定期第2周時(shí)兩組下頜骨牽張區(qū)骨組織形態(tài)(HE染色)

2.3 兩組成骨區(qū)TNTB、NBV比較 A、B組牽張成骨固定期第6周時(shí)成骨區(qū)TNTB、NBV均高于同組第2周時(shí)，相同檢測(cè)時(shí)點(diǎn)B組成骨區(qū)TNTB、NBV高于A組(P均<0.05)。詳見表1。

注：A為A組；B為B組。

圖4 牽張成骨固定期第6周時(shí)兩組下頜骨牽張區(qū)骨組織形態(tài)(HE染色)表1 牽張成骨固定期第2、6周時(shí)兩組成骨區(qū)TNTB、NBV比較

注：與同組第2周相比，*P<0.05；與A組同時(shí)點(diǎn)相比，#P<0.05。

2.4 兩組成骨區(qū)BMD、BMC比較 A、B組牽張成骨固定期第6周時(shí)成骨區(qū)BMD、BMC均高于同組第2周時(shí)，B組第6周時(shí)BMD、BMC高于同期A組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 牽張成骨固定期第2、6周時(shí)兩組成骨區(qū)BMD、BMC比較

注：與同組第2周相比，*P<0.05；與A組同時(shí)點(diǎn)相比，#P<0.05。

2.5 兩組成骨區(qū)生物力學(xué)指標(biāo)比較 A、B組牽張成骨固定期第6周時(shí)成骨區(qū)硬度、最大載荷、能量吸收均高于同組第2周時(shí)，且相同檢測(cè)時(shí)點(diǎn)B組高于A組(P均<0.05)。詳見表3。

表3 牽張成骨固定期第2、6周時(shí)兩組成骨區(qū)生物力學(xué)指標(biāo)比較

注：與同組第2周相比，*P<0.05；與A組同時(shí)點(diǎn)相比，#P<0.05。

3 討論

牽張成骨技術(shù)的主要原理為：將骨切斷但仍保留骨膜和周圍軟組織，對(duì)骨骼組織按一定方向施加適當(dāng)、穩(wěn)定的牽引力，激活成骨細(xì)胞的骨細(xì)胞增殖功能，使骨組織再生。牽張過程中，新骨在牽張間隙內(nèi)形成并礦化，同時(shí)周圍血管、神經(jīng)等軟組織也同步擴(kuò)張。牽張成骨技術(shù)有創(chuàng)傷小、無需植骨、不發(fā)生排斥反應(yīng)、面部軟硬組織比例協(xié)調(diào)、避免二次手術(shù)等優(yōu)點(diǎn)。然而由于多種技術(shù)尚未成熟，牽張成骨治療耗時(shí)較長(zhǎng)，新生骨組織可能會(huì)因牽張速度控制不好而造成礦化水平差等問題。上述兩方面是限制牽張成骨技術(shù)臨床推廣的關(guān)鍵問題，需要更加深入的探索和研究。為促進(jìn)牽張間隙的新骨形成及礦化、縮短牽張后的固定期，學(xué)者們不斷嘗試新的技術(shù)手段，包括應(yīng)用脫礦骨基質(zhì)、高壓氧、干細(xì)胞、細(xì)胞因子等，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中取得一定效果，但均未在臨床推廣使用。

骨的改建包括成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨礦物質(zhì)吸收，同時(shí)體液的配合會(huì)加速新骨的礦化及骨小梁的重新排列。臨床研究發(fā)現(xiàn)，健康成年人的骨骼吸收和重新生成速度達(dá)到平衡，如果這個(gè)過程失衡就會(huì)引起某些骨骼疾病的發(fā)生[2，3]。目前，大多數(shù)藥物是通過靶向抑制破骨細(xì)胞的生成來降低破骨細(xì)胞的骨吸收作用，如破骨細(xì)胞分化因子抑制劑。但是，由于破骨細(xì)胞的骨吸收作用和成骨細(xì)胞的骨形成作用之間具有相關(guān)性，此類藥物在抑制骨吸收作用的同時(shí)也可導(dǎo)致新骨形成減少。

臂板蛋白是由分泌型和細(xì)胞膜偶聯(lián)型蛋白組成的家族，是神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子的原型[4]。而作為一種趨化生長(zhǎng)因子的臂板蛋白3A，其不僅在胚胎期動(dòng)物脊髓中有表達(dá)，在成年動(dòng)物組織中亦有表達(dá)，可參與多種生理過程，并起到重要的調(diào)節(jié)作用[5～8]。臂板蛋白3A是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的軸突誘導(dǎo)分子，已被證實(shí)參與神經(jīng)系統(tǒng)主要結(jié)構(gòu)如腦、脊髓和周圍神經(jīng)的形成，成人神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)(如軸突再生和神經(jīng)修復(fù))。臂板蛋白3A及其受體在骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中都有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)健康成年大鼠注射臂板蛋白3A后可促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，破骨細(xì)胞數(shù)量有所減少；而對(duì)于骨骼缺損的成年鼠可使骨量增加，在去勢(shì)大鼠中會(huì)導(dǎo)致骨吸收減少[9]。臂板蛋白3A對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞起著雙重作用，是一種潛在的骨病治療藥物。也有研究[10]表明，臂板蛋白3A可對(duì)促進(jìn)新骨生成，同時(shí)會(huì)抑制破骨細(xì)胞的生成。有學(xué)者[11]觀察缺乏臂板蛋白3A的小鼠，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)骨質(zhì)破壞和骨合成調(diào)節(jié)因子、成骨細(xì)胞數(shù)量減少，表現(xiàn)為骨和軟骨發(fā)育不良、結(jié)構(gòu)異常等，提示臂板蛋白3A可能通過某種機(jī)制間接調(diào)節(jié)骨的形成。破骨細(xì)胞可經(jīng)核因子受體活化因子配體誘導(dǎo)生成，而臂板蛋白3A分泌的骨保護(hù)素(OPG)對(duì)破骨細(xì)胞分化因子的活性有抑制作用，從而抑制破骨細(xì)胞的合成。當(dāng)臂板蛋白3A缺乏時(shí)，破骨細(xì)胞分化信號(hào)可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，增加骨質(zhì)的破壞吸收[12～14]。臂板蛋白3A可阻斷OPG缺乏的條件性小鼠顱骨細(xì)胞中破骨細(xì)胞的形成，且缺乏臂板蛋白3A的小鼠表現(xiàn)明顯的骨量缺乏，從而證明臂板蛋白3A能抑制破骨細(xì)胞生成[15]。

常規(guī)牽張成骨建立模型時(shí)，通常先將骨完全切斷，再固定牽張器，這種方式骨斷端不能完全對(duì)齊，長(zhǎng)軸方向亦可能發(fā)生變化，不易與牽張器完全貼合，使?fàn)繌埰髀菪龡U旋轉(zhuǎn)阻力增大，致使后期骨骼愈合時(shí)發(fā)生錯(cuò)位、彎曲、變形，導(dǎo)致建模失敗。本次實(shí)驗(yàn)在建立牽張成骨模型時(shí)進(jìn)行了創(chuàng)新，先用來復(fù)鋸將兔下頜骨上2/3切開，確定牽張器安放位置及螺旋桿穿出皮膚的位置，使?fàn)繌埰髋c骨壁完全貼合，打孔并用螺絲固定牽張器后，再完全截?cái)喙趋馈＿@樣可使離斷的骨骼保持原有的長(zhǎng)軸方向，牽張成骨后，骨段只在原有的長(zhǎng)軸方向增長(zhǎng)，提高了手術(shù)的成功率。本研究借助X線檢查、骨組織形態(tài)觀察、DXA掃描、生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)，旨在觀察臂板蛋白3A對(duì)成骨效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，兩組的牽張間隙內(nèi)均有新骨形成并礦化，B組成骨情況優(yōu)于A組；A、B組牽張成骨固定期第6周時(shí)成骨區(qū)TNTB、NBV及成骨區(qū)硬度、最大載荷、能量吸收均高于同組第2周時(shí)，相同檢測(cè)時(shí)點(diǎn)B組高于A組；A、B組牽張成骨固定期第6周時(shí)成骨區(qū)BMD、BMC均高于同組第2周時(shí)，B組第6周時(shí)BMD、BMC高于同期A組。上述結(jié)果提示，外源性臂板蛋白3A能夠促進(jìn)兔下頜骨牽張間隙的愈合，促進(jìn)新骨形成，提高成骨效應(yīng)，縮短治療周期。臂板蛋白3A在臨床治療中有較好的應(yīng)用前景，以上結(jié)果為頜面部畸形矯正治療提供了新的思路。