潘玉雪 楊勇 林志淼

1北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科 北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 100034；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院遺傳室，南京 210042

色素失禁癥（incontinentia pigmenti，IP，OMIM 308300）又稱(chēng)為Bloch-Siemens 綜合征，是一種少見(jiàn)的X 連鎖顯性遺傳性皮膚?。?］，其發(fā)病率約為1/50 000。90%以上的患者為女性，大多數(shù)IP 男性患者病情較重，常常于宮內(nèi)死亡，只有極少數(shù)存在核型異常（47-XXY 性染色體異常型，即Klinefelter綜合征）、鑲嵌突變或輕型點(diǎn)突變等情況的男性患者可以存活［2-4］。該病主要表現(xiàn)為新生兒皮膚在發(fā)生紅斑、水皰、疣狀改變后，最終出現(xiàn)和遺留特征性分布的色素性改變，并且可伴有外胚層、眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼及其他器官異常等癥狀［5-8］。該病的致病基因?yàn)榫幋a核因子κB 關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（nuclear factor κB essential modulator，NEMO）的 NEMO 基因，其編碼蛋白在抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用［9-10］。我們?cè)谂R床上收集1個(gè)IP家系，對(duì)其進(jìn)行NEMO 基因突變檢測(cè)，并確定該家系的遺傳特點(diǎn)。

資料與方法

一、臨床資料

先證者女，9個(gè)月，為第1胎第1產(chǎn)，足月順產(chǎn)，出生后2 周無(wú)明顯誘因自四肢開(kāi)始出現(xiàn)棕褐色色素沉著斑，無(wú)紅斑、水皰，逐漸蔓延至全身。否認(rèn)父母近親婚育。皮膚科檢查：全身皮膚彌漫分布色素沉著斑，沿Blaschko 線(xiàn)分布，呈潑濺狀（圖1A ～1C）。其父38 歲，出生后全身出現(xiàn)散在紅斑伴癢，漸變黑，局部有增生改變；皮膚科檢查示軀干、四肢屈側(cè)及陰囊和陰莖皮膚沿Blaschko 線(xiàn)散在分布色素沉著斑，部分伴有局部增生隆起（圖1D ～1E）。牙、眼、骨骼系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等均正常。先證者父親色素沉著斑組織病理學(xué)檢查示，局限性角化過(guò)度，表皮增生，伴壞死角質(zhì)形成細(xì)胞，明顯界面改變，真皮乳頭可見(jiàn)噬黑素細(xì)胞（圖1F）。先證者及其父親均診斷為IP。患者母親及祖父、祖母均無(wú)類(lèi)似病史。

二、方法

1.DNA 提?。罕狙芯拷?jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)為2016［1024］），先證者及其家屬和健康對(duì)照均簽署知情同意書(shū)。抽取先證者及其父母和200例健康對(duì)照外周血4 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，用試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。取先證者父親石蠟包埋的皮損組織，用 E.Z.N.A.?FFPE DNA Kit 試劑盒（Omega Bio-Tek公司）提取組織DNA。

2.NEMO 基因4 ～10 號(hào)外顯子雜合性缺失檢測(cè)：根據(jù) Steffann 等［11］報(bào)道的長(zhǎng)鏈多重 PCR 擴(kuò)增方法，檢測(cè)先證者及其父親外周血DNA 中是否存在NEMO基因4 ～10號(hào)外顯子雜合性缺失。

圖1 色素失禁癥患者臨床及病理表現(xiàn) 1A ～1C：先證者軀干、四肢沿Blaschko線(xiàn)彌漫分布色素沉著斑，呈潑濺狀；1D、1E：先證者父親軀干和上肢內(nèi)側(cè)（包括乳頭和腋窩）沿Blaschko線(xiàn)散在分布色素沉著斑，局部增生隆起；1F：先證者父親皮損組織病理檢查示局限性角化過(guò)度，表皮增生，伴壞死角質(zhì)形成細(xì)胞、明顯界面改變，真皮乳頭可見(jiàn)無(wú)定形物質(zhì)沉積伴噬黑素細(xì)胞（HE×100）

（1）引物合成：參照文獻(xiàn)［11］設(shè)計(jì)引物。正向引物 Int3s：5′-CCACTCAGGGCTTAGAGCGC-3′，Rep3s：5′-CTCTTTTGACAAGAACACCGGA-3′；反向引物L(fēng)2Rev：5′-TCGGAGACACAGGAACCAGCA-3′。引物 Int3s/L2Rev 只能對(duì)具有 NEMO 基因 4 ～10 號(hào)外顯子雜合性缺失突變的IP 患者擴(kuò)增出1 045 bp 條帶，而引物Rep3s/L2Rev 可以對(duì)所有人擴(kuò)增出733 bp 條帶。由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成引物。

（2）PCR 反應(yīng)及電泳：根據(jù)文獻(xiàn)［11］推薦條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，取 5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，15 min后在凝膠成像儀下觀察結(jié)果并拍照。

3.PCR 擴(kuò)增 NEMO 基因 2 號(hào)外顯子、3 ～ 10 號(hào)外顯子長(zhǎng)片段和10號(hào)外顯子：首先，為了解先證者NEMO 基因是否存在致病性點(diǎn)突變的情況，利用PCR 擴(kuò)增所有血液樣本NEMO 基因2 號(hào)外顯子、3 ～10號(hào)外顯子長(zhǎng)片段，篩查先證者NEMO 基因全部編碼外顯子（即2 ～10號(hào)外顯子）及其側(cè)翼序列；然后，利用PCR 擴(kuò)增先證者父親石蠟包埋組織中NEMO 基因10 號(hào)外顯子，驗(yàn)證先證者父親皮損組織中是否存在與先證者外周血中一致的致病性突變位點(diǎn)。以1 例臨床確診的外周血DNA 中NEMO基因4～10 號(hào)外顯子缺失的典型色素失禁癥女性患者作為陽(yáng)性對(duì)照。

（1）引物設(shè)計(jì)和合成：根據(jù)NEMO基因序列（來(lái)源于 Ensembl 網(wǎng)站，網(wǎng)址：http：//www.ensembl.org/index.html），利用 Primer-BLAST 在線(xiàn)版（網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，覆蓋NEMO基因2號(hào)和10號(hào)外顯子及其側(cè)翼序列。2 號(hào)外顯子：正向引物5′-GCCCCAGAACTCATAGGCTT-3′，反 向 引物 5′-TGAAACCAAGAGGGAGGGCA-3′。10 號(hào)外顯子：正向引物 5′-ACATGAGTGGCCTGTGAGAC-3′，反向引物5′-TGGTTCGAGCAGACAGAAGG-3′。

NEMO 基因下游存在假基因△NEMO，NEMO基因與△NEMO 基因擁有相同的3 號(hào)至10 號(hào)外顯子的DNA 序列。根據(jù)NEMO 和△NEMO 基因序列（來(lái)源于UCSC網(wǎng)站，網(wǎng)址：http：//genome.ucsc.edu），利用真假基因在2號(hào)內(nèi)含子區(qū)域序列的不同，設(shè)計(jì)1 對(duì)僅針對(duì)NEMO 基因進(jìn)行擴(kuò)增的特異性引物，跨越 NEMO 基因 2 ～ 10 號(hào)內(nèi)含子區(qū)域，正向引物 5′-CCACTAACTTGCCTGGTCCAAG-3′，反向引物 5′-CTCCAGGTGGCATCCCAGTT-3′。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

（2）PCR 反應(yīng)體系及條件：2 號(hào)和10 號(hào)外顯子PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系均為25 μl，含基因組DNA 50 ng、dNTP 0.4 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、上下游引物各10 μmol/L、Taq DNA 聚合酶2.5 U。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s（每個(gè)循環(huán)后退火溫度降0.5 ℃），72 ℃延伸45 s，共10 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

3 ～ 10號(hào)外顯子PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μl，含基因組DNA 50 ng、dNTP 2.5 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、上下游引物各 10 μmol/L、LA Taq DNA 聚合酶2.5 U。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s、61.5 ℃退火30 s、68 ℃延伸15 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

（3）PCR 產(chǎn)物測(cè)序分析：所有PCR 產(chǎn)物純化后送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序方法為Sanger 雙脫氧鏈終止法。采用Bioedit 軟件將測(cè)序結(jié)果與NEMO基因組序列進(jìn)行對(duì)比。

結(jié) 果

一、先證者及其父親外周血DNA長(zhǎng)鏈多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖2 所示，先證者及其父親、健康對(duì)照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中均不存在長(zhǎng)度為1 045 bp的條帶，表明先證者及其父親均未發(fā)生NEMO 基因4 ～10 號(hào)外顯子缺失。

二、先證者外周血DNA中NEMO基因篩查結(jié)果

以血液DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，先證者NEMO基因第10號(hào)外顯子第1236和1237位核苷酸（從cDNA編碼起始位點(diǎn)ATG 算起）之間發(fā)生一個(gè)核苷酸A插入的雜合突變（c.1236dupA），導(dǎo)致其編碼氨基酸發(fā)生p.H413fs*7改變，2 ～9號(hào)外顯子均未檢測(cè)到致病性突變位點(diǎn)。其患病父親、未患病母親及健康人外周血DNA中均未檢測(cè)到此位點(diǎn)突變（圖3）。

圖2 多重PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 1：100 bp DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物；2：先證者；3：先證者父親；4：NEMO基因4 ～10號(hào)外顯子雜合性缺失的色素失禁癥患者（陽(yáng)性對(duì)照）；5：健康對(duì)照

圖3 NEMO 基因突變測(cè)序圖 3A：先證者外周血中存在c.1236dupA 雜合突變；3B、3C：先證者父母外周血中無(wú)c.1236dupA突變；3D：健康對(duì)照外周血中無(wú)c.1236dupA 突變；3E：先證者父親皮損組織中存在c.1236dupA鑲嵌突變

三、先證者父親皮損組織DNA中c.1236dupA突變驗(yàn)證結(jié)果

先證者父親皮損組織中存在與先證者外周血相同的c.1236dupA（p.H413fs*7）突變（圖3），測(cè)序圖中突變峰較野生型峰低，提示為體細(xì)胞鑲嵌突變。

討 論

IP 的主要臨床表現(xiàn)為新生兒期開(kāi)始出現(xiàn)沿Blaschko 線(xiàn)分布的特征性皮損。典型的IP 患者皮損表現(xiàn)為4期改變［1］。臨床上，診斷IP主要根據(jù)典型皮損表現(xiàn)和病理學(xué)特征，如果患者表現(xiàn)為新生兒期出現(xiàn)典型的紅色斑疹和相互重疊的其他3 期皮損，則很容易診斷為IP；但如果患者只表現(xiàn)出色素沉著斑或萎縮性色素減退斑，則會(huì)給臨床診斷帶來(lái)困難。

IP 被分為IP1（散發(fā)型）和IP2（遺傳型）。已報(bào)道的IP病例幾乎都為IP2。2000年，國(guó)際IP聯(lián)盟確認(rèn)位于染色體Xq28 上的NEMO 基因?yàn)镮P2 的致病基因［9］。NEMO 基因，也稱(chēng)為 IKBKG 基因，由 10 個(gè)外顯子（第一個(gè)外顯子不編碼）組成，編碼419個(gè)氨基酸，編碼蛋白為核因子（NF）-κB 關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是一種可激活NF-κB激酶的亞單位，對(duì)NF-κB活化至關(guān)重要，NF-κB 在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用［10，12-13］。NEMO基因突變導(dǎo)致其編碼蛋白NF-κB 關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子活性下降或失去活性，以至于只能部分甚至無(wú)法激活NF-κB，角質(zhì)形成細(xì)胞易感于腫瘤壞死因子誘導(dǎo)突變的凋亡，最終觸發(fā)皮膚炎性反應(yīng)而出現(xiàn)IP表型［14］。

與IP 相關(guān)的NEMO 基因突變的種類(lèi)多樣，包括基因重排、點(diǎn)突變、微重復(fù)和缺失等，但其中約80%的突變?yōu)镹EMO 基因4 ～10 號(hào)外顯子雜合性缺失［14-15］。本例先證者外周血中NEMO基因第10號(hào)外顯子發(fā)生c.1236dupA 雜合突變，導(dǎo)致氨基酸出現(xiàn)p.H413fs*7改變，移碼突變導(dǎo)致蛋白提前產(chǎn)生終止密碼子，因此致病意義明確。同時(shí)，該突變不存在于ExAC（Exome Aggregation Consortium）和1 000 G數(shù)據(jù)庫(kù)，并且不存在于未患病的母親和健康人外周血DNA中。檢索人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Gene Mutation Database，HGMD，建庫(kù)至2018 年4 月），未發(fā)現(xiàn)關(guān)于NEMO基因c.1236dupA（p.H413fs*7）突變的報(bào)道，證實(shí)其為新突變。該突變可能改變位于NEMO 蛋白C-末端的鋅指區(qū)ZF，最終影響核因子κB 激酶復(fù)合體和上游激活劑結(jié)合及NF-κB 激活［14］。有意思的是，我們?cè)谙茸C者父母的外周血DNA 中均沒(méi)有檢測(cè)出此突變，但在父親皮損組織中檢測(cè)出c.1236dupA 雜合突變。盡管未能進(jìn)行父親精液DNA 檢測(cè)，但根據(jù)父親皮損組織與其女兒血液突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果完全一致，并且父親有出生后皮膚出現(xiàn)散在紅斑的病史，其色素沉著斑皮損組織病理結(jié)果基本符合IP的Ⅱ至Ⅲ期皮損特征性病理表現(xiàn)，可以推測(cè)NEMO基因c.1236dupA突變可能為引起先證者及其父親IP 的原因，并且先證者NEMO 基因的c.1236dupA 突變很可能遺傳自父親的生殖細(xì)胞鑲嵌突變。父親皮損符合IPⅡ期（疣狀增生期），因IP 多數(shù)不發(fā)生于男性，臨床極容易被誤診為表皮痣，這在IP 患者診斷及家系調(diào)查中值得引起重視。

Fusco 等［14］發(fā)現(xiàn)具有相同NEMO 基因4 ～ 10號(hào)外顯子雜合性缺失突變的IP 患者表型有很大差異，輕者僅表現(xiàn)為皮膚異常色素沉著，重者還合并多個(gè)器官異常癥狀。Okita 等［16］報(bào)道 2 例具有NEMO 基因4 ～10 號(hào)外顯子雜合性缺失突變的IP患者的母親，無(wú)任何臨床癥狀。X染色體在胚胎時(shí)期隨機(jī)失活（萊昂化現(xiàn)象，lyonization）是導(dǎo)致IP 女性患者表型差異較大的重要原因。本例女性患兒的臨床癥狀較不典型，先證者從未出現(xiàn)過(guò)紅斑、水皰、丘疹、疣狀斑塊等皮疹，只在出生2周后無(wú)明顯誘因自四肢開(kāi)始出現(xiàn)棕褐色色素沉著斑。通過(guò)了解其家族史、檢測(cè)NEMO 基因，并且對(duì)其父親可疑皮損進(jìn)行病理學(xué)檢查及NEMO 基因突變位點(diǎn)驗(yàn)證等，最后確定IP診斷，并且推測(cè)先證者基因突變遺傳自父親的鑲嵌突變。

總之，對(duì)臨床上疑診為IP 的患者，詳細(xì)了解其家族史，進(jìn)行皮膚活檢和基因檢測(cè)對(duì)早期診斷、遺傳咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突