張英華 高佳 陳人萍 劉衛(wèi) 王清 張煒煜

摘 要 目的：建立測定苯唑嗪膠囊中主成分及有關(guān)物質(zhì)含量的方法。方法：采用高效液相色譜法測定主成分含量，采用主成分自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)（已知雜質(zhì)1、已知雜質(zhì)2、總雜質(zhì)）的含量。色譜柱為Inertsil ODS-2 C18，流動相為乙腈-水（55 ∶ 45，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為223 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：苯唑嗪主成分與雜質(zhì)分離度良好，苯唑嗪檢測質(zhì)量濃度線性范圍為20.04～60.12 μg/mL（r=1.000 0）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均≤0.5%（n=6）;平均回收率為97.50%（RSD=0.36%，n=3）;苯唑嗪的檢測限和定量限分別為0.91、3.04 ng。在3批樣品中，苯唑嗪、已知雜質(zhì)1、已知雜質(zhì)2、總雜質(zhì)含量的平均值分別為106.68%、0.002 1%、0.044 0%、0.046 2%。結(jié)論：建立的苯唑嗪膠囊中主成分及有關(guān)物質(zhì)的含量測定方法簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于苯唑嗪膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 苯唑嗪膠囊;高效液相色譜法;含量測定;有關(guān)物質(zhì)

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for content determination of main components and its related substances in Phenzolzine capsules. METHODS： HPLC method was adopted for content determination of main components. The contents of related substance （known impurity 1， known impurity 2， total impurity） were calculated with principle component self-control method. The determination was performed on Inertsil ODS-2 C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （55 ∶ 45， V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 223 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. RESULTS： The main component phenzolzine and other impurity peaks were well separated. The liner range of phenzolzine was 20.04-60.12 μg/mL （r=1.000 0）. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all ≤0.5% （n=6）. Average recovery was 97.50% （RSD=0.36%， n=3）. The detection limit and quantification limit of phenzolzine were 0.91 ng and 3.04 ng. In 3 batches of samples， average value of phenzolzine， known impurity 1， known impurity 2 and total impurity were 106.68%， 0.002 1%， 0.044 0% and 0.046 2%， respectively. CONCLUSIONS： Established method is simple， specific， sensitive and accurate for content determination of main component and related substance in Phenzolzine capsules. It is suitable for quality control of Phenzolzine capsules.

KEYWORDS? ?Phenzolzine capsules; HPLC; Content determination; Related substances

苯唑嗪（研發(fā)代號：Q808）化學(xué)名為6-（4-氯苯氧基）-四唑并[5，1-a]酞嗪，是一種新的抗癲癇藥物，具有增強(qiáng)腦內(nèi)核團(tuán)自發(fā)性抑制性突觸后電流（sIPSC）頻率、增加γ-氨基丁酸（GABA）含量的作用，其保護(hù)指數(shù)（PI）優(yōu)于卡馬西平和盧非酰胺，在整體和離體癲癇模型中均具有較強(qiáng)的抗癲癇作用，與傳統(tǒng)抗癲癇藥物苯妥英鈉、托吡酯相比，具有較強(qiáng)的抗驚厥作用且神經(jīng)毒性較低[1]。以苯唑嗪為原料制成的苯唑嗪膠囊目前已獲得臨床試驗(yàn)批件，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，在國內(nèi)外尚未有關(guān)于該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報道。為了保證用藥安全、有效，筆者根據(jù)《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[2]、《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]、《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]和2015年版《中國藥典》（四部）[5]的相關(guān)要求，另參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-11]，建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定苯唑嗪膠囊中主成分含量及有關(guān)物質(zhì)的方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010AHT型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、色譜工作站（日本島津公司）;KQ-2200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，文中采用參數(shù)為功率：250 W，頻率：40 kHz）;BT125D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

苯唑嗪對照品（批號：20140331，純度：>99.9%）、5-氯四唑并[5，1-a]酞嗪對照品[已知雜質(zhì)1[12]（以下簡稱雜質(zhì)1），批號：20140518，純度：>99.9%]、6-（2，4-二氯苯氧基）-四唑并[5，1-a]酞嗪對照品[已知雜質(zhì)2[12]（以下簡稱雜質(zhì)2），批號：20140518，純度：>99.9%]均由延邊大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研部制備;苯唑嗪膠囊（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室，批號：20140521、20140522、20140523，規(guī)格：0.15 g）;乳糖（美國Foremost Farms公司）;交聯(lián)聚維酮（PVPP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;微晶纖維素（湖州展望藥業(yè)有限公司）;聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus?，德國巴斯夫有限公司）;甲醇、乙腈均為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-水（55 ∶ 45，V/V）;檢測波長：223 nm;柱溫：25 ℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取苯唑嗪對照品10.04 mg，置于50 mL量瓶中，加乙腈超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）10 min;取出，放冷，稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于25 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含苯唑嗪40.16 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取苯唑嗪膠囊內(nèi)容物適量（約相當(dāng)于苯唑嗪10 mg），置于50 mL量瓶中，用乙腈超聲10 min;取出，放冷，稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于25 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取雜質(zhì)1、雜質(zhì)2對照品各5 mg，置于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得系統(tǒng)適用性貯備液;精密稱取苯唑嗪對照品10.06 mg，置于50 mL量瓶中;精密移取系統(tǒng)適用性貯備液1 mL，置于上述50 mL量瓶中，定容，搖勻，得系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.4 空白輔料溶液 按樣品處方精密稱取除苯唑嗪外的空白輔料適量，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，即得空白輔料溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液（批號：20140523）、系統(tǒng)適用性溶液及空白輔料溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，雜質(zhì)1、雜質(zhì)2與苯唑嗪的分離度>5，其余各峰之間的分離度>1.5，主峰拖尾因子為1.14～1.16，理論板數(shù)以主成分峰計>5 000，詳見圖1。

2.4 方法專屬性考察

取苯唑嗪膠囊10粒（批號：20140523）內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取約5 mg，共5份，分別置于25 mL量瓶中：1份加入1 mol/L的鹽酸溶液 5 mL，55 ℃水浴加熱3 h，用1 mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)節(jié)至中性，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞溶液;1份加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液 5 mL，靜置3 h，用1 mol/L的鹽酸溶液中和，調(diào)節(jié)至中性，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液;1份加入30%過氧化氫溶液5 mL，室溫放置3 h，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液;1份加入5 mL蒸餾水，70 ℃水浴加熱3 h，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞溶液;1份加入乙腈5 mL，使溶解，置于4 500 lx條件下照射18 h，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為光照破壞溶液。精密量取上述5種溶液及未破壞樣品溶液各20 μL，分別注入色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄其色譜圖。結(jié)果表明，樣品在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下均保持相對穩(wěn)定，各破壞條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物峰與主峰均能達(dá)到基線分離，且各峰間分離良好，詳見圖2。

2.5 線性關(guān)系考察

取苯唑嗪對照品10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取上述貯備液適量，用乙腈稀釋制成質(zhì)量濃度為20.04、24.05、32.06、40.08、48.10、60.12 μg/mL的系列質(zhì)量濃度對照品溶液。分別精密量取20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=22 971 318.110x+95 894.154（r=1.000 0）。結(jié)果表明，苯唑嗪檢測質(zhì)量濃度線性范圍為20.04～60.12 μg/mL。

2.6 檢測限和定量限試驗(yàn)

分別取“2.5”項(xiàng)下苯唑嗪對照品貯備液適量，均采用逐步稀釋法稀釋至3.2 μg/mL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以信噪比為3 ∶ 1計算[13]苯唑嗪的檢測限，結(jié)果為0.91 ng;以信噪比為10 ∶ 1計算苯唑嗪的定量限，結(jié)果為3.04 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的苯唑嗪對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果苯唑嗪峰面積的RSD為0.46%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20140523）適量，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算得到苯唑嗪峰面積的RSD為0.33%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取苯唑嗪膠囊樣品（批號：20140523）適量，平行6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得平均含量為99.98%，RSD為0.18%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

按樣品處方精密稱取空白輔料適量，共9份。精密稱取苯唑嗪對照品適量，置于50 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲溶解，再用乙腈稀釋至刻度，作為對照品溶液，分別取低、中、高不同體積的溶液各3份（含苯唑嗪的量分別約為400、500、600 μg），加入至9份空白輔料中，用乙腈稀釋并定量，取溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定并計算回收率，結(jié)果見表1。

2.11 耐用性試驗(yàn)

取苯唑嗪膠囊樣品（批號：20140523）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理制備供試品溶液，在選定流動相系統(tǒng)下，對不同色譜柱（色譜柱1：Agilent TC-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm;色譜柱2：Diamonsil-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm;色譜柱3：Inertsil ODS-2 C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用不同色譜柱進(jìn)行分析時，主峰與雜質(zhì)峰均能得到良好的分離，但以采用Inertsil ODS-2 C18色譜柱時峰形最佳。

在其他色譜條件不變情況下，考察流動相不同體積比[乙腈-水（52 ∶ 48、58 ∶ 42、55 ∶ 45，V/V）]、不同柱溫（25、30、35 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）及不同流動相pH（3、5、7）對含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果，4種變化條件下（各平行2次）苯唑嗪峰面積的RSD分別為0.22%（n=6）、0.19%（n=6）、0.20%（n=6）、0.26%（n=6），表明本方法耐用性良好。

2.12 樣品含量及有關(guān)物質(zhì)的檢查

2.12.1 樣品含量測定 精密稱取苯唑嗪對照品和苯唑嗪膠囊3批樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備對照品溶液和供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法以峰面積計算含量[14]，結(jié)果見表2。

2.12.2 樣品有關(guān)物質(zhì)檢查 取苯唑嗪膠囊3批樣品適量，精密稱定，分別加乙腈稀釋制成0.32 mg/mL的溶液，作為有關(guān)物質(zhì)供試品溶液;精密量取上述有關(guān)物質(zhì)供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)對照溶液。量取對照溶液20 μL，注入HPLC儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的20%;再精密量取有關(guān)物質(zhì)供試品溶液與有關(guān)物質(zhì)有關(guān)物質(zhì)對照溶液各20 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖至主成分保留時間的2倍。在有關(guān)物質(zhì)供試品溶液的色譜圖中如出現(xiàn)除空白輔料外的雜質(zhì)峰，按主成分自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的含量（單個雜質(zhì)不得過0.1%，總雜質(zhì)不得過0.3%）[15-17]，結(jié)果見表2。

由表2數(shù)據(jù)計算可知，在3批樣品中，苯唑嗪、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、總雜質(zhì)含量的平均值分別為106.68%、0.002 1%、0.044 0%、0.046 2%。

3 討論

苯唑嗪膠囊是針對癲癇治療研發(fā)的化學(xué)藥品1.1類新藥[18]，目前，相關(guān)研究已對苯唑嗪原料藥中的雜質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定及初步的測定[12]，但并未對其進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量檢查方法研究，特別是對苯唑嗪膠囊，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究的文獻(xiàn)報道。本試驗(yàn)采用HPLC法，對苯唑嗪膠囊主成分的含量及有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了深入研究，以更好、更全面地控制該制劑的質(zhì)量。

在色譜條件優(yōu)化過程中，筆者主要考察了流動相組成以及檢測波長對分離效果的影響。在流動相組成中，分別比較了甲醇-水和乙腈-水為流動相的分離效果，結(jié)果表明，選擇乙腈-水（55 ∶ 45，V/V）為流動相時，主成分與各雜質(zhì)間的分離效果良好（分離度>2），保留時間（雜質(zhì)1：5.355 min;主成分：12.224 min;雜質(zhì)2：18.088 min）合適，且主成分與雜質(zhì)均能滿足分析要求。采用二極管陣列檢測器對檢測波長進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)各成分在223 nm波長處有最大吸收，且靈敏度較高。故選擇223 nm作為本研究的檢測波長。

綜上所述，本研究建立的苯唑嗪膠囊中主成分及有關(guān)物質(zhì)的含量測定方法簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于苯唑嗪膠囊的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2019-04-01 修回日期：2019-05-27）

（編輯：劉 萍）