楊捷 朱泠音 徐翠珊 祝俠麗 田效志 賈永艷

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）17-2374-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.14

摘 要 目的：建立麥棗怡神顆粒的指紋圖譜，為其后續(xù)開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法：以10批麥棗怡神顆粒為樣品，采用高效液相色譜（HPLC）法建立指紋圖譜。色譜柱為Venusil XBP C18（L）;流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸（梯度洗脫）;流速在7～10 min時(shí)為1→0.7 mL/min，10～15 min時(shí)為0.7→1 mL/min，其余時(shí)間為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)分別為284 nm（0～7 min）、330 nm（7～32 min）、360 nm（32～45 min）;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004 A版）軟件生成指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，然后通過(guò)對(duì)照藥材及對(duì)照品對(duì)各共有峰進(jìn)行歸屬和指認(rèn)。結(jié)果：在方法學(xué)考察中，精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性均良好[各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<3%（n=6）]。10批樣品的相似度均在0.900以上。共確定了17個(gè)共有峰，其中共有峰1、6來(lái)自萊菔子，共有峰7、9、14、15、16來(lái)自陳皮，共有峰5、10、11、12、13來(lái)自甘草，共有峰2來(lái)自陳皮、甘草、酸棗仁，共有峰3來(lái)自甘草、萊菔子，共有峰8來(lái)自大麥、萊菔子，共有峰4、17均來(lái)自陳皮、甘草。并指認(rèn)了其中共有峰1為橙皮苷，共有峰9為芥子堿。結(jié)論：該方法建立的麥棗怡神顆粒指紋圖譜準(zhǔn)確、可靠，可以用于麥棗怡神顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 麥棗怡神顆粒;指紋圖譜;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);橙皮苷;芥子堿

Fingerprint Study of Maizao Yishen Granules

YANG Jie，ZHU Lingyin，XU Cuishan，ZHU Xiali，TIAN Xiaozhi，JIA Yongyan（School of Pharmacy， Henan University of TCM， Zhengzhou 450046， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Maizao yishen granules， and to provide scientific basis for its further development. METHODS： HPLC method was adopted to establish the fingerprint by using 10 batches of Maizao yishen granules sa samples. The determination was performed on Venusil XBP C18（L） column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1→0.7 mL/min at 7-10 min， 0.7→1 mL/min at 10-15 min and 1 mL/min at the rest of time. The detection wavelengths were set at 284 nm （0-7 min）， 330 nm （7-32 min） and 360 nm （32-45 min）. The column temperature was 25 ℃， and sample size was 10 μL. The fingerprint of Maizao yishen granules was established， and the similarity evaluation was performed by using “Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints” （2004 A edition） software. Then， the common peaks were assigned and identified by comparing reference substance and control medicinal materials. RESULTS： The precision， stability （24 h） and repeatability of the methodological investigation were all good [RSD values of relative retention time and relative peak area of each chromatographic peak were less than 3% （n=6）]. The similarity of 10 batches of samples were all above 0.900. Seventeen common peaks were identified， of which common peak 1 and 6 came from Semen Raphani; common peak 7， 9， 14， 15 and 16 from Citrus reticulata; common peak 5， 10， 11， 12 and 13 came from Glycyrrhiza uralensis; common peak 2 came from C. reticulata， G. uralensis and Ziziphus jujuba; peak 3 came from G. uralensis and Semen Raphani; peak 8 came from Hordeum vulgare and Semen Raphani; peak 4 and 17 came from C. reticulata and G. uralensis. Peak 1 was identified as hesperidin and the peak 9 was identified as sinapine. CONCLUSIONS： Established fingerprint of Maizao yishen granules is accurate and reliable， and can be used for quality control of Maizao yishen granules.

KEYWORDS Maizao yishen granules; Fingerprint; Quality standard; Hesperidin; Sinapine

抑郁癥在世界致殘性疾病中位居前列[1-2]。目前，治療抑郁癥主要以化學(xué)藥為主，再輔以心理治療[3]，但化學(xué)藥治療存在副作用大、依賴性強(qiáng)、易成癮等缺點(diǎn)[4]。近年來(lái)，研究具有抗抑郁作用的中成藥以替代化學(xué)藥已成為藥學(xué)研究的熱點(diǎn)[5]。麥棗怡神方劑是在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的復(fù)方，由大棗、大麥、萊菔子、陳皮、酸棗仁、百合、甘草七味中藥組成，主治脾氣虛、心神失養(yǎng)所導(dǎo)致的焦慮、失眠、健忘等癥。方中大棗、大麥為君藥，可養(yǎng)心補(bǔ)脾、安神定魂;萊菔子、陳皮為臣藥，可理氣健脾、寬胸下氣、守神安舍;酸棗仁、百合為佐藥，兩藥助君藥大棗、大麥安神定魂;甘草補(bǔ)脾益氣，調(diào)和諸藥。據(jù)臨床用藥反饋，麥棗怡神方劑療效顯著、不良反應(yīng)較少，但目前多以湯劑應(yīng)用，煎煮麻煩、不易保存，且患者依從性較差。因此，對(duì)該方劑進(jìn)行深入研究具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。故筆者將該方劑制成應(yīng)用方便、易于標(biāo)準(zhǔn)化并具有一定療效的麥棗怡神顆粒，以提高患者用藥的依從性[6]。為保證制劑質(zhì)量，本研究在麥棗怡神顆粒原有顯微鑒別和薄層鑒別質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行指紋圖譜研究，為麥棗怡神顆粒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀（包括2489紫外-可見光檢測(cè)器等）購(gòu)自美國(guó)Waters公司;SA224S-CW萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;KQ-100超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

10批麥棗怡神顆粒[河南中醫(yī)藥大學(xué)制藥實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)：20171121～20171130（依次記為S1～S10），規(guī)格：12 g/袋，每1 g含生藥量為0.5 g];橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：170428，純度：≥98%）、芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品（批號(hào)：160418，純度：≥98%）均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司;甘草飲片（批號(hào)：160501）、大麥飲片（批號(hào)：160521）、大棗飲片（批號(hào)：160401）、酸棗仁飲片（批號(hào)：160211）、萊菔子飲片（批號(hào)：160506）、百合飲片（批號(hào)：160330）均購(gòu)自禹州市凱旋藥業(yè)有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科董誠(chéng)明教授鑒定均為正品;甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：403022-07186，色譜純）;乙腈（美國(guó)Fisher Scientific公司，批號(hào)：11278，色譜純）;其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 麥棗怡神顆粒的制備

麥棗怡神方劑全方由大棗20 g、甘草9 g、大麥20 g、萊菔子15 g、陳皮9 g、酸棗仁15 g和百合15 g組成。按處方量取陳皮、酸棗仁、百合三味藥，以8倍量85%乙醇加熱回流提取3次，每次1 h;濾過(guò)，合并提取液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮提取液。藥渣與處方量的大棗、甘草、大麥、萊菔子混合，以12倍量水加熱提取2次 ，每次2 h，濾過(guò)，合并2次提取液。合并上述2種提取液，濃縮至相對(duì)密度為1.1的稠浸膏，微波干燥后，粉碎成細(xì)粉，加入糊精（藥材浸膏細(xì)粉與糊精的質(zhì)量比為1 ∶ 1）。然后用95%乙醇制軟材，通過(guò)制粒、干燥、整粒等步驟后即得麥棗怡神顆粒。

2.2 色譜條件

色譜柱：Venusil XBP C18（L）（250 mm×4.6 mm，5 ? ? μm）;柱溫：25 ℃;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～7 min，10%→16%A;7～10 min，16%→17%A;10～15 min，17%→18%A;15～25 min，18%→19%A;25～45 min，19%→70%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)：分別為284 nm（0～7 min）、330 nm（7～32 min）、360 nm（32～45 min）;流速：7～10 min為1→0.7 mL/min，10～15 min為0.7→1 mL/min，其余時(shí)間為1 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取麥棗怡神顆粒0.2 g，精密稱定，置于具塞平底燒瓶中，加入30 mL 75%甲醇，稱質(zhì)量，以功率500 W、頻率40 kHz超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，并以75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對(duì)照品2.38 mg、芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品2.26 mg，分別置于不同的10 mL量瓶中，加甲醇定容，分別制成質(zhì)量濃度為0.238 mg/mL的橙皮苷對(duì)照品溶液和0.226 mg/mL的芥子堿對(duì)照品溶液。

2.3.3 單味藥材供試品溶液的制備 按照1/4處方量，稱取大棗5 g、甘草2.25 g、大麥5 g、萊菔子3.75 g，分別加12倍量水，加熱回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾，合并2次濾液;取陳皮2.25 g、酸棗仁3.75 g、百合3.75 g，加8倍量85%乙醇，加熱回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾，合并3次濾液。分別取上述各味藥材濾液20 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，然后加甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，即得各單味藥材的供試品溶液。

2.3.4 缺味供試品溶液的制備 按照1/4處方量，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制成不含大棗、甘草、大麥、萊菔子、百合、陳皮、酸棗仁的缺味麥棗怡神顆粒，然后按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制備各缺味供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液（樣品批號(hào)：20171121），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖，并以橙皮苷峰（9號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積為參照，記算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液（樣品批號(hào)：20171121）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，然后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并以橙皮苷峰（9號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：20171121）適量，共6份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并以橙皮苷峰（9號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的生成、相似度評(píng)價(jià)及色譜峰的歸屬

2.5.1 指紋圖譜的生成 取10個(gè)不同批次的麥棗怡神顆粒適量，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將得到的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004 A版）軟件中，以S1色譜圖為參照譜圖，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.50 min，采用多點(diǎn)校正的方法進(jìn)行色譜峰匹配，采用中位數(shù)法生成麥棗怡神顆粒的對(duì)照指紋圖譜R。10批麥棗怡神顆粒的HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜R見圖1。

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 相似度是評(píng)價(jià)中藥指紋圖譜的一個(gè)重要參數(shù)， 據(jù)此分析中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性[7]。通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004 A）軟件，以生成的對(duì)照指紋圖譜R為參照，對(duì)10批麥棗怡神顆粒指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品的相似度分別為0.942、0.977、0.978、0.985、0.968、0.996、0.986、0.954、0.995、0.997，均大于0.900，表明樣品間差異較小，制劑工藝較穩(wěn)定。

2.5.3 共有指紋圖譜的標(biāo)定 根據(jù)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004 A版）軟件的分析結(jié)果，確定10批麥棗怡神顆粒指紋圖譜的共有峰和指紋峰，并以9號(hào)峰（橙皮苷峰）作為麥棗怡神顆粒指紋譜圖的參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，共獲得17個(gè)共有色譜峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明建立的麥棗怡神顆粒指紋圖譜合理。10批樣品的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果見表1，相對(duì)峰面積結(jié)果見表2。

2.5.4 色譜峰的歸屬 分別吸取“2.3.3”項(xiàng)下各單味藥材供試品溶液和“2.3.4”各缺味供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀，記錄色譜圖，通過(guò)保留時(shí)間及光譜信息對(duì)比，對(duì)指紋圖譜中的共有峰進(jìn)行歸屬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有峰1、6來(lái)自萊菔子;共有峰7、9、14、15、16來(lái)自陳皮;共有峰5、10、11、12、13來(lái)自甘草;共有峰2來(lái)自陳皮、甘草、酸棗仁;共有峰3來(lái)自甘草、萊菔子;共有峰8來(lái)自大麥、萊菔子;共有峰4、17均來(lái)自陳皮、甘草;未發(fā)現(xiàn)共有峰來(lái)自大棗和百合。對(duì)照藥材及缺味供試品的色譜圖見圖2。

2.5.5 共有峰的指認(rèn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間與紫外吸收光譜進(jìn)行比對(duì)，對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果，指認(rèn)了共有峰1為芥子堿、共有峰9為橙皮苷，對(duì)照品及對(duì)照指紋圖譜見圖3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

麥棗怡神顆粒由七味中藥組成，成分較復(fù)雜。筆者前期將麥棗怡神顆粒供試品溶液在190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)供試品溶液在284、330、360 nm波長(zhǎng)處均有較大的吸收。故在預(yù)試驗(yàn)時(shí)，分別在284、330和360 nm波長(zhǎng)下對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，以所得色譜圖中的峰數(shù)與分離度為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)分別在0～7 min時(shí)以284 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)、在7～32 min時(shí)以330 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)、在32～45 min時(shí)以360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行分析時(shí)，得到的峰數(shù)多且分離度好。故在本研究中筆者采用多波長(zhǎng)切換法進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，比較了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相體系的分離效果，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相時(shí)所得峰數(shù)最多且分離度好。由于在7～15 min內(nèi)色譜峰較多且不易分離，筆者嘗試在此時(shí)間段內(nèi)適當(dāng)降低流速，分別設(shè)定了10 min時(shí)的流速為0.9、0.8、0.7 mL/min，發(fā)現(xiàn)7～10 min時(shí)使流速逐漸降為0.7 mL/min、在10～15 min又逐漸升為1 mL/min時(shí)，此段峰分離效果最好，故在10 min時(shí)設(shè)置流速為0.7 mL/min。

3.3 參照峰的選擇

根據(jù)指紋圖譜參照物的選擇原則，參照峰一般應(yīng)選擇君藥中的有效成分，但大棗和大麥成分都比較簡(jiǎn)單，在指紋圖譜中沒有共有峰，提示其在此指紋圖譜中沒有太大相關(guān)性。而陳皮中的橙皮苷含量高，成分穩(wěn)定，在該指紋圖譜中的分離度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均良好，因此以橙皮苷為參照峰來(lái)評(píng)價(jià)麥棗怡神顆粒的色譜指紋圖譜是可靠的。

中藥指紋圖譜在反映中藥制劑所含化學(xué)成分的種類、數(shù)量以及中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[9]，目前已廣泛應(yīng)用于中藥制劑的質(zhì)控領(lǐng)域[10-12]。筆者對(duì)10批麥棗怡神顆粒進(jìn)行了指紋圖譜的構(gòu)建，由于復(fù)方制劑中成分復(fù)雜，有些共有峰并非來(lái)源于同一藥材，故筆者只定性指認(rèn)了來(lái)源單一、峰面積較大的共有峰1和共有峰9。大棗作為方中君藥之一，百合作為方中佐藥，在對(duì)照指紋圖譜中沒有顯示出共有峰，分析原因可能是大棗的主要成分為多糖，百合醇提成分主要為總皂苷，而這兩類有效部位的檢測(cè)波長(zhǎng)與麥棗怡神顆粒的檢測(cè)波長(zhǎng)均相差較大。橙皮苷和芥子堿的色譜條件在檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相上均有較大差異，故筆者并未建立同時(shí)測(cè)定芥子堿和橙皮苷含量的方法。10批麥棗怡神顆粒樣品生成的圖譜的相似度較高，表示樣品間差異較小，表明麥棗怡神顆粒產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性較好。

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（收稿日期：2019-04-04 修回日期：2019-07-01）

（編輯：林 靜）