張娜 謝俊霞 徐華敏

[摘要]?目的?探討外源性鐵蛋白（Ferritin）對1-甲基-4-苯基吡啶陽離子（MPP+）誘導(dǎo)的MES23.5細胞損傷的作用。

方法用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法篩選MPP+最適造模濃度;分別應(yīng)用MPP+、Ferritin、Ferritin+MPP+處理MES23.5多巴胺能神經(jīng)細胞，然后應(yīng)用CCK8試劑盒檢測細胞存活率，流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體跨膜電位（△Ψm）。

結(jié)果MPP+處理MES23.5細胞后，細胞存活率和△Ψm均下降，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=143.044、70.924，P<0.01）。Ferritin預(yù)處理4 h可明顯抑制MPP+導(dǎo)致的細胞存活率和△Ψm的下降（F=51.905、35.218，P<0.01）。

結(jié)論Ferritin對MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細胞損傷具有保護作用，能夠拮抗MPP+誘導(dǎo)的細胞存活率和△Ψm的下降。

[關(guān)鍵詞]?鐵蛋白質(zhì)類;帕金森病;1-甲基-4-苯基吡啶;神經(jīng)保護

[中圖分類號]?R338;R977.6

[文獻標(biāo)志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）01-0028-04

EFFECT OF FERRITIN ON MES23.5 CELL DAMAGE INDUCED BY 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM

ZHANG Na， XIE Junxia， XU Huamin

（Department of Physiology and Pathophysiology， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of exogenous ferritin on MES23.5 cell damage induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+）.

MethodsMethyl thiazolyl tetrazolium colorimetry was used to screen out the optimal concentration of MPP+ for modeling. MES23.5 dopaminergic neural cells were treated with MPP+， ferritin， or ferritin+MPP+. CCK8 assay was used to measure cell viability， and flow cytometry was used to measure mitochondrial transmembrane potential （ΔΨm）.

Results

Compared with the control group， the MPP+ treatment group had significant reductions in cell viability and ΔΨm of MES23.5 cells （F=143.044 and 70.924，P<0.01）. Ferritin pretreatment for 4 hours significantly inhibited the reductions in cell viability and ΔΨm induced by MPP+ （F=51.905 and 35.218，P<0.01）.

ConclusionFerritin exerts a protective effect against MPP+-induced damage in MES23.5 cells and can antagonize the reductions in cell viability and ΔΨm induced by MPP+.

[KEY WORDS]ferritins; Parkinson disease; 1-Methyl-4-phenylpyridinium; neuroprotection

帕金森?。≒D）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)主要有靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢反射障礙等，其病理特征主要為中腦黑質(zhì)（SN）致密帶多巴胺（DA）能神經(jīng)元死亡[1]。雖然PD的病因尚未完全明確，但越來越多的證據(jù)表明SN鐵沉積是PD發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[2-4]。鐵蛋白（Ferritin）是一種中空的對稱蛋白質(zhì)，由24個亞基組成，分子量約48萬，其空芯中可儲存多達4 500個鐵原子[5-7]。有研究結(jié)果證實，PD病人SN中Ferritin水平下降，并且Ferritin的負荷量高于正常[8-9]。本實驗旨在探討外源性Ferritin對1-甲基-4-苯基吡啶陽離子（MPP+）誘導(dǎo)的MES23.5細胞損傷的作用，從而為PD診斷和干預(yù)提供可靠的實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1?材料與方法

1.1?材料

MES23.5細胞（由大鼠的中腦神經(jīng)元和小鼠的神經(jīng)母細胞瘤細胞雜交而成的融合細胞系）由樂衛(wèi)東教授惠贈。DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，多聚賴氨酸、羅丹明123（Rh123）、Ferritin、四甲基偶氮唑鹽（MTT）均購自美國Sigma公司，青霉素-鏈霉素溶液（100×）購自江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所，CCK8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2MES23.5細胞培養(yǎng)

在細胞培養(yǎng)之前，先應(yīng)用100 mg/L的多聚賴氨酸處理細胞培養(yǎng)瓶，再用無菌三蒸水洗3次。將MES23.5細胞從液氮中復(fù)蘇后用培養(yǎng)液懸浮，接種于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中。之后用加入血清的培養(yǎng)液每2～3 d傳代1次。

1.3?MTT法篩選MPP+濃度

將MES23.5細胞以8×107/L的密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)48 h后，棄上清，再分別加入終濃度為0、50、100、150、200、300 μmol/L的MPP+處理24 h。細胞處理結(jié)束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板，棄上清，每孔加入100 μL的DMSO，震蕩5 min。用酶標(biāo)儀在波長570 nm處測各孔吸光度（A）值。

1.4?實驗分組

在確定MPP+造模濃度的基礎(chǔ)上，后續(xù)實驗分為4組：對照組、MPP+處理組、Ferritin處理組、Ferritin+MPP+處理組。將MES23.5細胞以1×108/L的密度種植于12孔板中，每孔1 mL。第3天分組處理細胞，對照組和MPP+處理組換用無血清培養(yǎng)液，F(xiàn)erritin處理組和Ferritin+MPP+處理組加入80 mg/L Ferritin，孵育4 h后，MPP+處理組和Ferritin+MPP+處理組再加入MPP+，繼續(xù)孵育24 h，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5CCK8實驗

細胞處理結(jié)束后，棄去上清，每孔加入CCK8溶液100 μL，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定各孔在波長450 nm處的A值。按照公式（A加藥-A空白）/（A0加藥-A空白）計算細胞存活率，A加藥為有細胞、CCK8溶液和藥物孔的A值，A空白為有培養(yǎng)液和CCK8溶液而沒有細胞孔的A值，A0加藥為有細胞、CCK8溶液而沒有藥物孔的A值。

1.6?細胞線粒體跨膜電位（△Ψm）的檢測

細胞處理后棄上清，每孔加5 mg/L的Rh123溶液1 mL，37 ℃避光負載30 min，以0.01 mol/L的HBS洗2次后，每孔加入新的HBS 1 mL，吹打成單細胞懸液，用300目鋼絲網(wǎng)過濾。將樣品加入流式細胞儀的樣品管中，以激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長523 nm進行測定。FCS/SSC設(shè)門，收集門內(nèi)10 000個細胞，用CELLQuest Pro分析系統(tǒng)分析每組細胞的熒光強度。

1.7?統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所得計量數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，單因素影響組間比較采用單因素方差分析;多因素影響的比較采用析因設(shè)計的方差分析，若存在交互作用則進行簡單效應(yīng)分析，若無交互作用則報告主效應(yīng)結(jié)果。以P<0.05為差異有顯著性。

2?結(jié)??果

2.1不同濃度的MPP+對MES23.5細胞存活率的影響

不同濃度MPP+作用MES23.5細胞24 h后，0、50、100、150、200、300 μmol/L MPP+處理組的細胞存活率分別為1.00±0.11、0.75±0.07、0.68±0.73、0.63±0.82、0.58±0.10、0.55±0.06（n=5）。50、100、150、200、300 μmol/L MPP+處理組與未用MPP+處理組相比，細胞存活率均有不同程度的降低（F=31.15，P<0.01），且呈濃度依賴性。若細胞存活率過高則損傷不夠，細胞存活率過低則造成細胞不可逆死亡，最終選用100 μmol/L作為MPP+最適造模濃度進行后續(xù)實驗。

2.2Ferritin對MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細胞存活率下降的影響

對照組、MPP+處理組、Ferritin處理組、Ferritin+MPP+處理組的細胞存活率分別為1.00±0.04、0.70±0.05、1.02±0.03、0.89±0.04（n=6）。析因設(shè)計方差分析顯示，MPP+和Ferritin兩種因素存在交互作用（F=13.792，P<0.01），進而進行簡單效應(yīng)分析。100 μmol/L MPP+處理MES23.5細胞24 h后，MPP+處理組細胞存活率較對照組有明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=143.044，P<0.01）;Ferritin處理組與對照組相比，細胞存活率差異無顯著性（F=2.851，P>0.05）;與MPP+處理組相比，F(xiàn)erritin+MPP+處理組MPP+誘導(dǎo)的細胞存活率下降受到明顯抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=51.905，P<0.01）。

2.3Ferritin對MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細胞△Ψm下降的影響

對照組、MPP+處理組、Ferritin處理組、Ferritin+MPP+處理組細胞△Ψm分別為100.00±5.49、72.56±8.34、97.52±7.21、90.36±8.78（n=6）。析因設(shè)計方差分析顯示，MPP+和Ferritin兩種因素存在交互作用（F=26.336，P<0.01），進而進行簡單效應(yīng)分析。應(yīng)用100 μmol/L MPP+處理MES23.5細胞24 h后，MPP+處理組細胞△Ψm較對照組有明顯的下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=70.924，P<0.01）;Ferritin處理組與對照組相比較，△Ψm差異無顯著意義（F=1.325，P>0.05）;與MPP+處理組相比，F(xiàn)erritin+MPP+處理組MPP+誘導(dǎo)的細胞△Ψm下降受到明顯抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=35.218，P<0.01）。

3?討??論

PD是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，但其確切的病因及發(fā)病機制尚未完全闡明。研究表明，年齡老化、環(huán)境因素、遺傳因素、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等均可能參與了DA能神經(jīng)元的變性死亡過程[2，10-14]。大量研究證實，PD病人SN鐵異常沉積，腦內(nèi)鐵代謝紊亂，鐵沉積通過Fenton反應(yīng)催化產(chǎn)生具有高細胞毒性的羥自由基[15-17]，誘發(fā)DA能神經(jīng)元變性壞死，導(dǎo)致PD發(fā)病[18-21]。DEXTER等用熱油提取和離心法從PD病人腦組織中提取蛋白，發(fā)現(xiàn)在PD病人的SN和全腦中Ferritin水平都下降，并且PD病人SN中Ferritin的負荷量超過正常[8]。鐵含量增加而Ferritin表達未出現(xiàn)上調(diào)使SN區(qū)DA能神經(jīng)元更容易受到氧化應(yīng)激損傷[9，22]。

在腦內(nèi)，鐵主要與Ferritin結(jié)合[23]。Ferritin由重鏈（FTH）和輕鏈（FTL）組成，其空腔可以儲存多達4 500個鐵原子[5，24]。FTH含有鐵氧化酶，負責(zé)將可溶性亞鐵轉(zhuǎn)化成可儲存的三價鐵，有助于鐵在Ferritin中的積累[25-26]。FTL不含有這些酸性氨基酸，但存在成核位點，其主要功能是促進鐵的礦化和核的形成[27]。在Ferritin儲存鐵的初期，F(xiàn)e2+在FTH的鐵氧化酶中心被氧化成Fe3+，并形成含鐵-磷的二聚體水合物，然后該二聚體在成核位點被水解，最終形成鐵核[28]。

MPP+作用于DA能神經(jīng)元或細胞系被認為是經(jīng)典的PD細胞模型之一，MPP+可與線粒體復(fù)合物Ⅰ結(jié)合，阻礙呼吸鏈電子傳遞，導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起ATP的耗竭，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[29]。在氧化應(yīng)激的刺激下，F(xiàn)e2+從溶酶體或內(nèi)吞體釋放，通過線粒體的鈣單向轉(zhuǎn)運體進入線粒體，或者通過內(nèi)吞體/溶酶體直接到線粒體的鐵轉(zhuǎn)運機制進入線粒體，加重線粒體的氧化應(yīng)激損傷。本實驗中用MPP+處理MES23.5細胞后，細胞存活率和△Ψm均下降，提示線粒體功能受損。而Ferritin預(yù)處理可明顯抑制MPP+誘導(dǎo)的細胞存活率和△Ψm的下降，在一定程度上能保護細胞免受氧化應(yīng)激的損傷，從而保護DA能神經(jīng)元。本實驗為PD的治療提供了新的靶點和思路。

[參考文獻]

[1]NASSIF D V， PEREIRA J S. Fatigue in Parkinsons disease：concepts and clinical approach[J]. ?Psychogeriatrics， 2018，18（2）：143-150.

[2]COOKSON M R. The biochemistry of Parkinsons disease[J]. ?Annual Review of Biochemistry， 2005，74：29-52.

[3]DE FARIAS C C， MAES M， BONIFACIO K L， et al. ?Parkinsons disease is accompanied by intertwined alterations in iron metabolism and activated immune-inflammatory and oxidative stress pathways[J]. ?CNS & Neurological Disorders-Drug Targets， 2017，16（4）：484-491.

[4]JIANG H， WANG J， ROGERS J， et al. ?Brain iron metabolism dysfunction in Parkinsons disease[J]. ?Molecular Neurobiology， 2017，54（4）：3078-3101.

[5]KOORTS A M， VILJOEN M. Ferritin and ferritin isoforms Ⅰ：structure-function relationships，synthesis，degradation and secretion[J]. ?Arch Physiol Biochem， 2007，113（1）：30-54.

[6]THEIL E C， BEHERA R K， TOSHA T. Ferritins for che-mistry and for life[J]. ?Coordination Chemistry Reviews， 2013，257（2，SI）：579-586.

[7]THEIL E C. Ferritin：the protein nanocage and iron biomineral in health and in disease[J]. ?Inorganic Chemistry， 2013，52（21）：12223-12233.

[8]FAUCHEUX B A， MARTIN M E， BEAUMONT C， et al. ?Neuromelanin associated redox-active iron is increased in the substantia nigra of patients with Parkinsons disease[J]. ?Journal of Neurochemistry， 2003，86（5）：1142-1148.

[9]FAUCHEUX B A， MARTIN M E， BEAUMONT C， et al. ?Lack of up-regulation of ferritin is associated with sustained iron regulatory protein-1 binding activity in the substantia nigra of patients with Parkinsons disease[J]. ?Journal of Neurochemistry， 2002，83（2）：320-330.

[10]REEVE A， SIMCOX E， TURNBULL D. Ageing and Parkinsons disease：why is advancing age the biggest risk factor[J]？ ?Ageing Research Reviews， 2014，14（100）：19-30.

[11]DAUER W， PRZEDBORSKI S. Parkinsons disease：mechanisms and models[J]. ?Neuron， 2003，39（6）：889-909.

[12]SHULMAN J M， DE JAGER P L， FEANY M B. Parkin-sons disease：genetics and pathogenesis[J]. ?Annu Rev Pathol， 2011，6：193-222.

[13]BRAAK H， DEL TREDICI K， RB U， et al. ?Staging of brain pathology related to sporadic Parkinsons disease[J]. ?Neuro-biology of Aging， 2002，24（2）：197-211.

[14]SULZER D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinsons disease[J]. ?Trends in Neurosciences， 2007，30（5）：244-250.

[15]WYPIJEWSKA A， GALAZKA-FRIEDMAN J， BAUMIN-GER E R， et al. ?Iron and reactive oxygen species activity in Parkinsonian substantia nigra[J]. ?Parkinsonism & Related Disorders， 2010，16（5）：329-333.

[16]GOZZELINO R， AROSIO P. Iron homeostasis in health and disease[J]. ?International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（1）：130.

[17]SUN Y， PHAM A， WAITE T D. The effect of vitamin C and iron on dopamine-mediated free radical generation： implications to Parkinsons disease[J]. ?Dalton Transactions， 2018，47（12）：4059-4069.

[18]HARE D J， ARORA M， JENKINS N L， et al. ?Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration[J]？ ?Nature Reviews Neurology， 2015，11（9）：536-544.

[19]BENARROCH E E. Brain iron homeostasis and neurodegene-rative disease[J]. ?Neurology， 2009，72（16）：1436-1440.

[20]LOGROSCINO G， GAO X， CHEN H L， et al. ?Dietary iron intake and risk of Parkinsons disease[J]. ?Am J Epidemiol， 2008，168（12）：1381-1388.

[21]ZECCA L， STROPPOLO A， GATTI A， et al. ?The role of iron and copper molecules in the neuronal vulnerability of locus coeruleus and substantia nigra during aging[J]. ?Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004，101（26）：9843-9848.

[22]QUINTANA C， GUTIERREZ L. Could a dysfunction of ferritin be a determinant factor in the aetiology of some neurodegenerative diseases[J]？ ??Biochimica et Biophysica Acta-Ge-neral Subjects， 2010，1800（8，SI）：770-782.

[23]AROSIO P， INGRASSIA R， CAVADINI P. Ferritins： a fa-mily of molecules for iron storage， antioxidation and more[J]. ?Biochimica et Biophysica Acta， 2009，1790（7）：589-599.

[24]LINDER M C. Mobilization of stored iron in mammals： a review[J]. ?Nutrients， 2013，5（10）：4022-4050.

[25]SAKAMOTO S， KAWABATA H， MASUDA T， et al.

H-ferritin is preferentially incorporated by human erythroid cells through transferrin receptor 1 in a threshold-dependent manner[J]. ?PLoS One， 2015，10（10）：e0139915.

[26]LI L， FANG C J， RYAN J C， et al. ?Binding and uptake of H-ferritin are mediated by human transferrin receptor-1[J]. ?Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2010，107（8）：3505-3510.

[27]KOORTS A M， VILJOEN M. Ferritin and ferritin isoforms Ⅱ： protection against uncontrolled cellular proliferation，oxidative damage and inflammatory processes[J]. ?Archives of Physiology and Biochemistry， 2007，113（2）：55-64.

[28]TESFAY L， HUHN A J， HATCHER H， et al. ?Ferritin blocks inhibitory effects of two-chain high molecular weight kininogen （HKa） on adhesion and survival signaling in endothelial cells[J]. ?PLoS One， 2012，7（7）：e40030.

[29]KOTAKE Y， OHTA S. MPP plus analogs acting on mitochondria and inducing neuro-degeneration[J]. ?Current Medicinal Chemistry， 2003，10（23）：2507-2516.