賈璐 石麗敏 謝俊霞

[摘要]?目的?探討A型鉀通道抑制劑4-氨基吡啶（4-AP）對l-甲基4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的帕金森病（PD）模型小鼠運動行為的影響。

方法8周齡雄性C57BL/6小鼠30只，隨機分為對照組、MPTP組以及4-AP+MPTP組，每組10只。采用連續(xù)5 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg-1·d-1）的方法制備PD小鼠模型。4-AP+MPTP組在每天注射MPTP前30 min腹腔注射4-AP（1 mg·kg-1·d-1），對照組以等量生理鹽水代替MPTP和4-AP。連續(xù)5 d注射后進行爬桿實驗檢測。

結(jié)果MPTP組小鼠爬桿實驗的轉(zhuǎn)頭時間和爬桿時間明顯長于對照組，而4-AP+MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時間和爬桿時間較MPTP組明顯縮短，差異均有顯著意義（F=32.26、25.53，P<0.01）。

結(jié)論4-AP可使MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠運動協(xié)調(diào)能力有所改善。

[關(guān)鍵詞]?4-氨基吡啶;l-甲基4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶;帕金森病;運動障礙

[中圖分類號]?R742.5;R971.8

[文獻標(biāo)志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）01-0044-03

EFFECT OF 4-AP ON MOTOR BEHAVIOR IN MPTP MOUSE MODEL OF PARKINSONS DISEASE

JIA Lu， SHI Limin， XIE Junxia

（Department of Physiology， State Key Disciplines： Physiology， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of 4-aminopyridine （4-AP）， an inhibitor of A-type potassium channel， on motor behavior in mice with Parkinsons disease （PD） induced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）.

MethodsThirty 8-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into MPTP group， 4-AP+MPTP group， and control group， with 10 mice per group. The mice in the MPTP group and 4-AP+MPTP group received intraperitoneal injection of MPTP （30 mg·kg-1·d-1） for 5 consecutive days to establish a mouse model of PD; in addition， the mice in the 4-AP+MPTP group were intraperitoneally injected with 4-AP （1 mg·kg-1·d-1） 30 min before the daily injection of MPTP. As for the control group， MPTP and 4-AP were replaced by an equal volume of normal saline. The pole test was performed after 5 consecutive days of injection.

ResultsThe time to turn around and time to reach the floor in the MPTP group were significantly longer than those in the control group， while they were significantly shortened in the 4-AP+MPTP group compared with the MPTP group （F=32.26 and 25.53，P<0.01）.

ConclusionInhibition of A-type potassium channel by 4-AP may attenuate motor coordination dysfunction in mice with MPTP-induced PD.

[KEY WORDS]4-aminopyridine; 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine; Parkinson disease; motor disorders

帕金森?。≒D）又稱震顫麻痹，是常見的神經(jīng)退行性疾病。其病理特征主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失，紋狀體多巴胺含量減少[1]。PD的病因及發(fā)病機制尚未完全明確，可能與遺傳、環(huán)境、氧化應(yīng)激、鐵沉積、自身免疫、細胞凋亡等因素相關(guān)[2-9]。目前使用的1-二羥基苯丙氨酸、多巴胺前體和多巴胺激動劑等療法在改善PD運動損傷方面僅取得了有限的成功。因此，尋找療效可靠、不良反應(yīng)少的PD治療藥物是亟待解決的重要問題[10]。近年來研究表明，PD的發(fā)病可能與鉀離子通道的功能異常相關(guān)，因而PD也被認(rèn)為是一種“離子通道病”[11-15]。以鉀離子通道為靶點的PD治療思路已成為目前該病治療研究領(lǐng)域中的一個重要的探索方向。A型鉀通道是電壓依賴性鉀離子通道的重要分支，在控制神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等方面發(fā)揮重要作用[12]。以往研究結(jié)果表明，A型鉀通道特異性阻斷劑4-氨基吡啶（4-AP）能夠增強黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性[16-17]。本實驗選用經(jīng)典神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶（MPTP）制備PD小鼠模型，通過爬桿實驗進一步評價4-AP對PD模型小鼠運動行為的影響。

1?材料與方法

1.1?動物及分組

[CM（20]SPF級8周齡雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量（20±2）g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（蘇）2016-0010。小鼠于20 ℃、晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng)，可自由攝食、飲水、活動。實驗前讓其適應(yīng)環(huán)境1周。將小鼠隨機分為對照組（A組）、MPTP組（B組）和4-AP+MPTP組（C組），每組10只。

1.2?給藥方法

各組小鼠均給予連續(xù)5 d腹腔注射，MPTP組腹腔注射MPTP（購自美國Sigma公司）30 mg·kg-1·d-1，4-AP+MPTP組在每天注射MPTP前30 min腹腔注射4-AP（購自英國TOCRIS公司）1 ?mg·kg-1·d-1，對照組則以等量生理鹽水代替MPTP和4-AP。

1.3?爬桿實驗

制作一根直徑1 cm、長50 cm 的桿，在其頂端固定一個直徑為1.5 cm 小球，頂端小球纏上紗布以增加摩擦力，將桿豎直放置在一個方形的塑料盆中。實驗開始時，將小鼠頭放置在小球上，記錄小鼠從開始運動到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時間（轉(zhuǎn)頭時間）和爬桿時間。每只小鼠進行3次實驗，取平均值[18]。

1.4?統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，所得計量數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組比較采用One-way ANOVA檢驗，以Turkey法進行組間兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)??果

MPTP組小鼠爬桿實驗的轉(zhuǎn)頭時間和爬桿時間明顯長于對照組，而4-AP+MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時間和爬桿時間較MPTP組明顯縮短，差異均有顯著性（F=32.26、25.53，P<0.01）。表明MPTP組小鼠的運動協(xié)調(diào)能力嚴(yán)重受損，給予4-AP預(yù)處理則改善了小鼠的運動協(xié)調(diào)能力。見表1。

3?討??論

A型鉀通道又稱為瞬時外向型鉀通道，是一種電壓依賴型鉀通道，在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元上廣泛表達，具有較大的電流幅度（從數(shù)百pA到15 nA左右）。在哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，A型鉀通道主要由Kv4基因家族形成的α亞基以及KChip基因

家族形成的輔助β亞基共同組成，其中Kv4基因家族包括KCND1、KCND2和KCND3，KChip家族包括KChip1、KChip2、KChip3和KChip4[19-21]。

Kv4.3/KChip3.1是A型鉀通道在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元上的主要組成部分[22]。以往研究結(jié)果證實，A型鉀通道對動作電位的幅度、動作電位時程發(fā)揮著重要的精細調(diào)節(jié)作用，阻斷該通道則可以明顯提高多巴胺能神經(jīng)元的放電頻率[16-17]。由于紋狀體區(qū)多巴胺的釋放可被黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的電活動變化直接影響，A型鉀通道的阻斷劑可以通過抑制IA提高神經(jīng)元的興奮性，增加多巴胺的含量[23]。因此，4-AP可能通過調(diào)控中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的電活動，改善黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的功能，從而有效緩解PD運動功能障礙。

本實驗采用連續(xù)5 d腹腔注射MPTP方法制備亞急性PD小鼠模型。MPTP是一種神經(jīng)毒素，極易通過血-腦脊液屏障，具有強脂溶性。MPTP本身沒有毒性，進入腦內(nèi)后，在線粒體內(nèi)單胺氧化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镸PP+，隨后，多巴胺能神經(jīng)元通過細胞膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運體特異性攝取MPP+，細胞內(nèi)游離的MPP+通過耗能的主動轉(zhuǎn)運方式進入線粒體與呼吸鏈的復(fù)合物結(jié)合，阻斷線粒體電子傳遞系統(tǒng)，導(dǎo)致能量代謝障礙和自由基的生成增加，最終導(dǎo)致細胞死亡[24]。除上述氧化應(yīng)激、線粒體功能損傷等毒性機制外，近期研究還顯示MPP+可以降低黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性，減少細胞的自發(fā)放電[25-26]。由于神經(jīng)元興奮性的變化與多巴胺遞質(zhì)的含量以及運動功能密切相關(guān)，因此本研究首先觀察了MPTP制備的PD小鼠模型運動行為的變化。本文研究結(jié)果顯示，腹腔注射MPTP使小鼠運動能力明顯降低，出現(xiàn)與PD病人類似的肌張力增高、運動遲緩等表現(xiàn)，在爬桿實驗中的轉(zhuǎn)頭時間和爬桿時間明顯延長。而給予4-AP預(yù)處理組小鼠的轉(zhuǎn)頭時間和爬桿時間較MPTP組明顯縮短，表明4-AP預(yù)處理能明顯改善MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運動功能障礙。推測其機制可能是由于4-AP抑制了A型鉀通道，提高了多巴胺能神經(jīng)元的興奮性，進而增加了紋狀體多巴胺的含量，使PD模型小鼠的運動障礙癥狀得到改善。本實驗為進一步深入研究鉀離子通道在PD中的作用提供了一定的實驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1]CHEN Leilei， XIE Junxia. Dopamine in Parkinsons disease：precise supplementation with motor planning[J]. ?Neuroscience Bulletin， 2018，34（5）：873-874.

[2]FLEMING S M. Mechanisms of gene-environment interactions in Parkinsons disease[J]. ?Current Environmental Health Reports， 2017，4（2）：192-199.

[3]XU Huamin， LIU Xiaodong， XIA Jianjian， et al. Activation of NMDA receptors mediated iron accumulation via modulating iron transporters in Parkinsons disease[J]. ?FASEB Journal， 2018，32（11）：6100-6111.

[4]SONG Ning， XIE Junxia. Iron， dopamine， and alpha-synuc-lein interactions in at-risk dopaminergic neurons in Parkinsons disease[J]. ?Neuroscience Bulletin， ?2018，34（2）：382-384.

[5]DE BAAT C， VAN STIPHOUT M E， LOBBEZOO F， et al. Parkinsons disease：pathogenesis， aetiology， symptoms， diagnostics， and its course[J]. ?Nederlands Tijdschrift Voor Tandheelkunde， 2018，125（10）：509-515.

[6]RAMPRASAD C， DOUGLAS J Y， MOSHIREE B. Parkinsons disease and current treatments for its gastrointestinal neurogastromotility effects[J]. ?Current Treatment Options in Gastroenterology， 2018，16（4）：489-510.

[7]GRUNEWALD A， KUMAR K R， SUE C M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinsons disease[J]. ?Progress in Neurobiology， 2018. doi：10.1016/j.pneurobio.2018.09.003.

[8]RADI E， FORMICHI P， BATTISTI C， et al. Apoptosis and oxidative stress in neurodegenerative diseases[J]. ?Journal of Alzheimers Disease， 2014，42（3）：S125-S152.

[9]JIANG Tianfang， LI Gen， XU Jun， et al. The challenge of the pathogenesis of Parkinsons disease：is autoimmunity the culprit[J]？ Frontiers in Immunology， 2018，9：02047.

[10]CHARVIN D， MEDORI R， HAUSER R A， et al. Therapeutic strategies for Parkinson disease：beyond dopaminergic drugs[J]. ?Nature Reviews Drug Discovery， 2018. doi：10.1038/nrd.2018.184.

[11]WANG Gang， ZENG Jie， REN Rujing， et al. Potassium channels in the basal ganglia：promising new targets for the treatment of Parkinsons disease[J]. ?Frontiers in Bioscience：a Journal and Virtual Library， 2008，13：3685-3698.

[12]CHEN Xiaoyan， XUE Bao， WANG Jun， et al. Potassium channels：a potential therapeutic target for Parkinsons disease[J]. ?Neuroscience Bulletin， 2018，34（2）：341-348.

[13]WANG Yan， YANG Penglin， TANG Jifei， et al. Potassium channels：possible new therapeutic targets in Parkinsons di-sease[J]. ?Medical Hypotheses， 2008，71（4）：546-550.

[14]劉海霞，陳小燕，薛寶，等. XE991對6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病模型大鼠運動行為影響[J]. ?青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2017，53（1）：5-7，11.

[15]DUDA J， POETSCHKE C， LISS B. Converging roles of iron channels， calcium， metabolic stress， and activity pattern of substantia nigra dopaminergic neurons in health and Parkinsons disease[J]. ?Journal of Neurochemistry， 2016，139（1）：156-178.

[16]SEGEV D， KORNGREEN A. Kinetics of two voltage-gated K+ conductances in substantia nigra dopaminergic neurons[J]. ?Brain Research， 2007，1173：27-35.

[17]KUZNETSOVA A Y， HUERTAS M A， KUZNETSOV A S， et al. Regulation of firing frequency in a computational model of a midbrain dopaminergic neuron[J]. ?Journal of Computational Neuroscience， 2010，28（3）：389-403.

[18]樊開陽，朱麗娜，張文利，等. MPTP誘導(dǎo)小鼠帕金森病亞急性模型和慢性模型的比較[J]. ?中國老年學(xué)雜志， 2017，37（1）：4-6.

[19]TANG Yiquan， ZHOU Jingheng， YANG Fan， et al. The tetramerization domain potentiates Kv4 channel function by suppressing closed-state inactivation[J]. ?Biophysical Journal， 2014，107（5）：1090-1104.

[20]ZEMEL B M， RITTER D M， COVARRUBIAS M， et al. A-type KV channels in dorsal root ganglion neurons：diversity， function， and dysfunction[J]. ?Frontiers in Molecular Neuroscience， 2018，11：253.

[21]薛寶，常曉麗，賈璐，等. Ghrelin抑制A型鉀通道電流對小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元興奮性的影響[J]. ?青島大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2018，54（2）：127-129，133.

[22]DUFOUR M A， WOODHOUSE A， GOAILLARD J M. So-matodendritic ion channel expression in substantia nigra pars compacta dopaminergic neurons across postnatal development[J]. ?Journal of Neuroscience Research， 2014，92（8）：981-999.

[23]AIDI-KNANI S， REGAYA I， AMALRIC M， et al. Kv4 channel blockade reduces motor and neuropsychiatric symptoms in rodent models of Parkinsons disease[J]. ?Behavioural Pharmacology， 2015，26（1/2， SI）：91-100.

[24]SCHILDKNECHT S， DI MONTE D A， PAPE R， et al. Tipping points and endogenous determinants of nigrostriatal degeneration by MPTP[J]. ?Trends in Pharmacological Sciences， 2017，38（6）：541-555.

[25]MASI A， NARDUCCI R， LANDUCCI E， et al. MPP+-dependent inhibition of Ih reduces spontaneous activity and enhances EPSP summation in nigral dopamine neurons[J]. ?British Journal of Pharmacology， 2013，169（1）：130-142.

[26]YEE A G， LEE S M， HUNTER M R， et al. Effects of the parkinsonian toxin MPP+ on electrophysiological properties of nigral dopaminergic neurons[J]. ?NeuroToxicology， 2014，45（45）：1-11.