劉雪琳 朱志 何勇 葉開溫 田志宏

摘要：【目的】研究印度梨形孢（Piriformospora indica）對鹽（NaCl）脅迫后水稻幼苗生長發(fā)育的影響，明確印度梨形孢提高水稻幼苗耐鹽性的機理?！痉椒ā坎捎貌煌瑵舛龋?、50、100、150和200 mmol/L）的鹽（NaCl）溶液處理水稻幼苗，72 h后加入5×105個/mL的印度梨形孢孢子懸浮液10 mL侵染水稻根部（接種處理），以未侵染為對照（不接種，CK）;20 d后測定水稻幼苗葉片的丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性等生理指標，并利用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測耐鹽相關基因的表達情況?！窘Y果】鹽脅迫處理后，與CK相比，接種處理水稻幼苗的MDA含量降低，葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性升高。其中，鹽脅迫濃度為150和200 mmol/L時，CK的MDA含量是接種處理的1.5和2.8倍;鹽脅迫濃度為150 mmol/L時，接種處理的Pro含量是CK的2.1倍;鹽脅迫濃度為200 mmol/L時，接種處理的可溶性糖含量是CK的1.8倍;差異均達顯著水平（P<0.05，下同）。qPCR檢測結果表明，經鹽脅迫后接種處理水稻幼苗葉片中耐鹽相關基因SNAC1、OsNAC6、OsBZIP23和OsDREB2A的表達量均高于CK，各基因表達量均在100 mmol/L處理下達最大值，其中SNAC1和OsNAC6基因表達量分別是CK的1.5和1.1倍，差異達顯著水平?！窘Y論】接種印度梨形孢可降低鹽脅迫后水稻幼苗葉片的MDA含量，提高抗氧化酶活性及Pro、葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量，同時促使水稻葉片中耐鹽脅迫相關基因的表達量上調，從而增強水稻幼苗對鹽脅迫的耐受性。印度梨形孢作為生物菌肥在農業(yè)生產中有潛在的利用價值。

關鍵詞： 印度梨形孢;水稻;耐鹽性;酶活性;基因表達

中圖分類號： S511.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0719-07

Abstract：【Objective】Study on the effects of Piriformospora indica on the growth and development of rice seedlings under salt stress（NaCl） was conducted，and the mechanism of P. indica improving salt tolerance of rice seedlings was also researched. 【Method】Rice seedlings were treated with different concentrations（0，50，100，150 and 200 mmol/L） of salt（NaCl） solution. After 72 h，5×105 spore/mL P. indica spore suspension was added to infect rice roots（inoculation treatment）. With the absence of dip-dyeing as control（CK）， 20 d later，the physiological indicators such as malondialdehyde（MDA），proline（Pro），chlorophyll，soluble sugar， soluble protein contents and antioxidant enzyme activities in rice seedling leaves were determined. Real-time fluorescence quantitative PCR（qPCR） was used to detect the expression of salt-to-lerant genes. 【Result】After salt stress treatment，compared with CK，MDA content decreased，chlorophyll，soluble sugar and soluble protein content and antioxidant enzyme activities increased in infected rice seedlings. Among them，when the salt concentrations were 150 and 200 mmol/L，the MDA contents of CK were as 1.5 and 2.8 times as that of P. indica treatment; when the salt concentration was 150 mmol/L，the Pro content of? P. indica inoculated rice was as 2.1 times as that of CK; when the salt concentration was 200 mmol/L，the soluble sugar content of P. indica treatment was as 1.8 times as that of CK; the differences were significant（P<0.05，the same below）. The results of qPCR showed that the expression levels of salt-tolerant genes SNAC1，OsNAC6，OsBZIP23 and OsDREB2A in the leaves of rice seedlings after salt stress were higher than those of CK，and the expression level of each gene reached the maximum at 100 mmol/L.The expression levels of SNAC1 and OsNAC6 genes in P. indica seedlings were as 1.5 and 1.1 times as those of CK，respectively，and the diffe-rences were significant. 【Conclusion】Inoculation with P. indica can decrease the MDA content and increase the activities of antioxidant enzymes，Pro，chlorophyll，soluble sugar and soluble protein contents in rice seedling leaves under salt stress，and also promote the up-regulation of salt tolerance-related genes in rice leaves， and finally enhance the tolerance of rice seedlings to salt stress. P. indica has potential to be uses as a biological fertilizer in agricultural production.

Key words： Piriformospora indica; rice; salt tolerance; enzyme activity; gene expression

0 引言

【研究意義】水稻是世界上的主要糧食作物之一。水稻常受各種惡劣環(huán)境因素的脅迫，如干旱脅迫、鹽脅迫及寒冷脅迫等。鹽堿脅迫是抑制作物生產力最主要的環(huán)境因素，土壤鹽堿化不僅使土壤板結，還會限制農作物的生長發(fā)育，降低農作物產量。印度梨形孢（Piriformospora indica）由印度科學家Verma等從沙漠的灌木根上分離獲得，其作用與叢枝菌根真菌極為相似，可在許多種作物的根部定殖（Varma et al.，1999;Singh et al.，2000），能促進植物生長（Varma et al.，1999;Waller et al.，2005），加快植物對氮、磷等礦物質的吸收，提高作物對逆境脅迫的忍耐性（Waller et al.，2005）。因此，研究印度梨形孢對水稻幼苗耐鹽性的影響及作用機理，對鹽堿土地改良及提高水稻產量有重要作用。【前人研究進展】孫超（2010）研究發(fā)現(xiàn)，在對印度梨形孢侵染的小白菜進行干早脅迫時，小白菜葉片中干旱相關基因DREB2A、CBLA1、ANAC072、RD29A的表達上調，類囊體膜鈣離子相關敏感調節(jié)因子CAS mRNA水平和CAS蛋白的表達增加;馬杰（2012）研究發(fā)現(xiàn)，接種印度梨形孢的煙苗在鹽濃度為100和300 mmol/L的培養(yǎng)基上能重新生根發(fā)育，而未接種印度梨形孢的煙苗只能在鹽濃度為100 mmol/L的培養(yǎng)基上生根發(fā)育，在鹽濃度300 mmol/L時無法生長;陳佑源等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下接種印度梨形孢的油菜葉片中編碼合成脂質轉運蛋白的基因575表達上調;惠非瓊（2014）研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，接種和未接種印度梨形孢的煙草葉片中鹽脅迫相關蛋白基因PR-1a、PR2、PR3、PR5均上調表達，但在接種印度梨形孢煙草中的表達量顯著高于未接種印度梨形孢的煙草;李亮等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢能提高植物體內抗氧化物酶活性，增加游離脯氨酸含量并誘導BADH基因的表達;吳金丹等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢對水稻地上部生長的促進作用與葉綠素含量、硝酸還原酶活性、根系活力和生長相關調控基因的表達有關，印度梨形孢可能通過提高光合速率、增強水稻對礦質營養(yǎng)的吸收與利用和誘導生長素的分泌，促進水稻地上部的生長;李亮等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢可誘導脯氨酸合成酶基因（P5CS）的表達并增強紫花苜蓿的耐鹽害能力;韋巧等（2017）研究表明，印度梨形孢能提高生菜對磷元素的吸收，促進生菜生長?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關印度梨形孢在水稻耐鹽作用中的研究較少，其對水稻耐鹽性的影響尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】采用不同濃度的鹽（NaCl）溶液處理水稻幼苗，再用印度梨形孢侵染水稻根部，20 d后測定水稻幼苗葉片的丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性等生理指標，并利用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測耐鹽相關基因的表達情況，探討印度梨形孢提高水稻幼苗耐鹽性的機理。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株與水稻品種 印度梨形孢菌種及水稻品種9311均由長江大學生命科學學院實驗室保存提供。

1. 1. 2 印度梨形孢培養(yǎng) 挑取活化的菌絲塊在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)7 d。加入一定量的無菌水，用滅菌玻璃棒進行反復刮取得到孢子，經勻漿機打勻、超聲波處理后，在血球計數(shù)板計數(shù)。

1. 1. 3 水稻幼苗準備 選擇健康成熟的水稻種子，先置于70%乙醇溶液中8 min，以無菌水沖洗3次，再置于0.5%次氯酸鈉溶液中10 min，以無菌水沖洗3次，然后置于裝有200 mL無菌水的燒杯中，在30 ℃黑暗培養(yǎng)箱中浸種2 d。挑取破胸的種子并將其置于含有濕潤雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，在30 ℃黑暗條件下催芽3 d。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 水稻幼苗鹽脅迫及印度梨形孢侵染 將發(fā)芽的水稻幼苗移入裝有300 mL水培營養(yǎng)液的塑料杯（直徑95 mm、高122 mm）中進行懸浮培養(yǎng)，待水稻幼苗生長10 d后進行鹽脅迫處理，分別加入0、50、100、150 和200 mmol/L的NaCl溶液，72 h后將水稻幼苗根部析出的鹽清洗干凈后移栽到無菌土上培養(yǎng)，然后加入5×105個/mL的印度梨形孢孢子懸浮液10 mL侵染水稻根部（接種處理），以未侵染為對照（不接種，CK），每個濃度處理5次重復。

1. 2. 2 印度梨形孢定殖檢測 印度梨形孢定殖觀察采用臺盼藍染色法（Kumar et al.，2011），將印度梨形孢侵染20 d的水稻根部在自來水下沖洗干凈，剪取根尖1 cm以上部分，剪成1 cm的小段。在10% KOH中浸泡12 h，取出后用1% HCl中和5 min，再用5%臺盼藍溶液染色1 min，之后用清水沖洗8～10次。在顯微鏡下觀察印度梨形孢侵染情況。

1. 2. 3 相關生理指標測定 隨機采集生長20 d的水稻幼苗，放入采樣袋，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定（鄒琦，2007），Pro含量采用酸性茚三酮法測定（陳建勛和王曉峰，2006），葉綠素含量采用丙酮—乙醇提取法測定（趙世杰，2000），過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測定（高俊鳳，2006），過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定（李合生，2000），超氧化物歧化酶（SOD）活性采用淡藍四唑法測定（李合生，2000），可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定（楊志敏，2015），可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定（鄒琦，2007）。

1. 2. 4 RNA提取及qPCR檢測 印度梨形孢處理水稻20 d后，從每盆水稻中隨機取1株進行qPCR檢測分析。用TransZol Up提取樣品總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，qPCR反應體系10.0 μL：TransStar Tip Green qPCR SuperMix（2×）5.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補足至10.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據采用Excel 2007進行數(shù)據處理和制圖，利用SPSS 13.0進行數(shù)據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2. 1 印度梨形孢的侵染情況

由圖1可看出，通過倒置顯微鏡觀察水稻根部印度梨形孢的侵染情況，發(fā)現(xiàn)水稻的主根較側根更易被侵染，即根部越粗，印度梨形孢越容易定殖。

2. 2 印度梨形孢侵染對鹽脅迫后水稻幼苗生長及生理指標的影響

2. 2. 1 印度梨形孢侵染后水稻幼苗的生長狀況 由圖2可看出，鹽脅迫濃度為0、50和100 mmol/L時，接種處理水稻幼苗的莖和根均比CK長;鹽濃度為150和200 mmol/L時，接種處理水稻幼苗和CK的葉片均呈枯萎狀態(tài)，但CK比接種處理水稻幼苗的葉片枯萎更嚴重。

2. 2. 2 印度梨形孢侵染后水稻幼苗MDA含量的變化 由圖3可看出，經不同濃度NaCl脅迫后，接種處理水稻幼苗葉片中MDA含量相對較低，而CK水稻幼苗葉片中MDA含量在150和200 mmol/L處理下上升較快，分別是接種處理的1.5和2.8倍，二者差異顯著（P<0.05，下同）。表明鹽脅迫下接種印度梨形孢后水稻幼苗膜脂過氧化程度低，受鹽害程度低，對鹽脅迫的耐受能力相對增強。

2. 2. 3 印度梨形孢侵染后水稻幼苗Pro含量的變化 由圖4可看出，經鹽脅迫處理后，水稻幼苗葉片中Pro含量在0～100? mmol/L處理下變化不明顯。與CK相比，接種處理的水稻葉片中Pro含量在150和200 mmol/L處理下較CK明顯增加，其中150 mmol/L處理是CK的2.1倍，差異顯著。表明印度梨形孢可促進鹽脅迫下水稻幼苗葉片中Pro的積累。

2. 2. 4 印度梨形孢侵染后水稻幼苗SOD、POD和CAT活性的變化 由圖5可看出，隨鹽脅迫濃度的增加，水稻幼苗葉片中SOD和POD活性整體上呈增加趨勢，CAT活性則呈先增加后減小的變化趨勢;與CK相比，接種處理水稻幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性相對較高，且均在鹽脅迫濃度為150 mmol/L時達最高值。說明接種印度梨形孢可提高鹽脅迫后水稻幼苗葉片中的抗氧化酶活性，相對增強其耐鹽脅迫的能力。

2. 2. 5 印度梨形孢侵染后水稻幼苗葉綠素含量的變化 由圖6可看出，經鹽脅迫后，水稻幼苗葉片的葉綠素含量均隨鹽脅迫濃度的增加持續(xù)下降。與CK相比，接種印度梨形孢各處理水稻幼苗葉片的葉綠素含量均相對較高，但差異未達顯著水平（P>0.05，下同）。

2. 2. 6 印度梨形孢侵染后水稻幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化 由圖7可看出，隨鹽脅迫濃度的增加，水稻幼苗葉片的可溶性糖含量整體上呈增加趨勢，可溶性蛋白含量則先增加后減少。接種處理的可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于CK，其中200 mmol/L處理的可溶性糖含量與CK差異顯著，是CK的1.8倍;接種處理不同鹽脅迫濃度的可溶性蛋白含量與CK均未達顯著差異水平。

2. 3 耐鹽相關基因的表達分析結果

由圖8可看出，經鹽脅迫后，接種處理水稻幼苗葉片中耐鹽相關基因SNAC1、OsNAC6、OsBZIP23和OsDREB2A的表達量均高于CK，各基因表達量均隨鹽脅迫濃度的增加呈先升高后降低的變化趨勢，均在100 mmol/L處理下達最大值，其中接種處理水稻幼苗的SNAC1和OsNAC6基因表達量分別是CK的1.5和1.1倍，差異達顯著水平。說明鹽脅迫下，接種印度梨形孢能誘導水稻葉片中耐鹽相關基因的表達。

3 討論

當植物處于逆境脅迫時，體內活性氧的產生與清除平衡遭到破壞，活性氧大量積累引起膜脂過氧化，MDA含量增加。本研究結果表明，在進行不同程度的鹽脅迫后，接種印度梨形孢水稻幼苗葉片中的MDA含量低于未接種印度梨形孢的水稻幼苗，與惠非瓊（2014）對印度梨形孢提高煙草耐鹽性的研究結果相似，未接種印度梨形孢的水稻幼苗葉片中MDA的含量呈上升趨勢，特別是高鹽脅迫下，MDA含量上升很快，說明水稻幼苗細胞抗氧化體系遭到破壞，活性氧含量增加，膜脂過氧化程度上升，細胞膜系統(tǒng)遭到破壞;而接種印度梨形孢的水稻幼苗葉片中MDA含量上升較慢，說明印度梨形孢可降低活性氧含量，減輕膜脂過氧化程度，進而提高水稻幼苗的抗氧化能力。

鹽脅迫促使植物產生活性氧（Lee et al.，2001），如超氧化物自由基、羥基和過氧化氫等，可對植物造成氧化脅迫（Yamauchi et al.，2002）。植物自身可產生保護機制，如可清除活性氧的抗氧化酶體系，包括CAT、POD、SOD和谷胱甘肽還原酶等。當植物處于逆境條件下，抗氧化系統(tǒng)清除活性氧能力下降，造成活性氧大量積累對細胞造成傷害。本研究結果表明，水稻幼苗在受到鹽脅迫時，SOD、POD和CAT活性隨鹽脅迫濃度的增加呈先上升后下降的變化趨勢，接種印度梨形孢水稻幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性比未接種印度梨形孢的水稻上升迅速且積累量高，表明印度梨形孢可有效激活水稻幼苗葉片中的活性氧清除系統(tǒng)，降低活性氧含量，減輕膜脂過氧化。

在正常條件下，植物體內游離脯氨酸含量很低，其積累指數(shù)與植物的抗逆性有關，是鹽脅迫下最有效的滲透調節(jié)物質（Ashraf and Foodlad，2007;Flowers and Colmer，2008;Szabados and Savouré，2010;Boscaiu et al.，2013）。本研究中，經不同程度的鹽脅迫后，接種印度梨形孢的水稻幼苗葉片中Pro積累量明顯高于未接種印度梨形孢的水稻幼苗，說明印度梨形孢可能是通過增加細胞中Pro的積累來維持細胞膜完整性，從而提高水稻幼苗的耐鹽性，與陳佑源等（2013）對印度梨形孢對油菜抗旱性影響的研究結果相似。

葉片葉綠素含量是植物生長時對環(huán)境較敏感的生理指標。本研究結果表明，接種和未接種印度梨形孢水稻幼苗葉片的葉綠素含量均隨鹽脅迫濃度的增加呈下降趨勢。然而，在相同鹽濃度處理下，接種印度梨形孢水稻幼苗的葉綠素含量高于未接種印度梨形孢的水稻幼苗，說明接種印度梨形孢可能降低了葉綠素的分解或促進了葉綠素的合成，從而降低水稻幼苗對環(huán)境的敏感性。

在鹽脅迫下，植物為降低由脅迫造成的生理代謝不平衡，細胞會大量積累一些小分子有機化合物來維持其正常的生理功能。可溶性糖是鹽脅迫誘導的小分子溶質之一，參與細胞的滲透調節(jié);可溶性蛋白也是重要的滲透調節(jié)物質和營養(yǎng)物質。本研究結果表明，可溶性糖含量在高鹽條件下急劇上升，此時接種印度梨形孢的水稻幼苗中可溶性糖含量高于未接種印度梨形孢的水稻幼苗，說明接種印度梨形孢能減緩水稻幼苗因脅迫造成的生理代謝不平衡，使細胞積累可溶性糖來參與滲透調節(jié)，以維持細胞的正常代謝功能。同時，接種印度梨形孢水稻幼苗各處理的可溶性蛋白含量均高于未接種印度梨形孢的水稻幼苗，說明接種印度梨形孢后可使水稻幼苗葉片的可溶性蛋白含量得到積累，進而提高細胞的保水功能。

水稻OsNAC6基因能在高鹽脅迫下誘導表達，且OsNAC6基因在水稻受到傷害的情況下誘導能力非常強（Xie et al.，2000）?；莘黔偅?014）研究表明，印度梨形孢能誘導鹽脅迫下煙草中耐鹽相關基因OPBP1、PR-1a、PR2、PR3和PR5大量表達。本研究發(fā)現(xiàn)，接種印度梨形孢的水稻葉片中SNAC1、OsNAC6、OsBZIP23和OsDREB2A基因的表達量高于未接種印度梨形孢的水稻，推測印度梨形孢提高水稻耐鹽性是通過誘導某種逆境基因的協(xié)同表達而實現(xiàn)，但具體原因尚有待進一步研究。

4 結論

接種印度梨形孢可降低鹽脅迫后水稻幼苗葉片的MDA含量，提高抗氧化酶活性、Pro、葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量，同時促使水稻葉片中耐鹽脅迫相關基因的表達量上調，從而增強水稻幼苗對鹽脅迫的耐受性。印度梨形孢作為生物菌肥在農業(yè)生產中有潛在的利用價值。

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（責任編輯 王 暉）