楊 翠,趙錦花

(1.長(zhǎng)春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130032; 2.長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林延吉 133002)

夏枯草(PrunellavulgarisL)為唇形科夏枯草屬多年生草本植物,別名麥穗夏枯草、鐵線夏枯草,麥夏枯、鐵線夏枯、乃東等。夏枯草在我國(guó)分布廣泛,以河南、安徽、湖南、江蘇等省為主要產(chǎn)地[1-2]。夏枯草全草及其干燥果穗均可入藥,味苦、性辛寒[3-4]。其藥理活性廣泛,主要為清熱明目、瀉肝火、利尿等[4-5]。夏枯草作為食品也被廣泛使用,如可用于涼茶[6]、煲湯、涼拌等。

夏枯草主要含三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、苯丙素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等成分[7-8]。目前,夏枯草集中于萜類、苷類及黃酮類等非揮發(fā)性成分提取與藥理活性的研究成果報(bào)道較多[9-10],而對(duì)揮發(fā)油及其揮發(fā)性成分的報(bào)道較少[11-12]。楊超[11]報(bào)道夏枯草中發(fā)現(xiàn)16種揮發(fā)性成分,王海波[12]研究中發(fā)現(xiàn)17種揮發(fā)性成分。已有文獻(xiàn)中檢測(cè)到的揮發(fā)性成分均有限,且均是以全草進(jìn)行研究,無(wú)法確定各部位特征成分,這將限制夏枯草揮發(fā)性成分的深入研究。

藥用植物中揮發(fā)性成分的萃取方法主要有水蒸氣蒸餾法[12]、超臨界流體法[11]等,水蒸氣蒸餾法存在提取率低,耗時(shí)且主要萃取低沸點(diǎn)物質(zhì)等缺點(diǎn)[12];超臨界流體法設(shè)備較昂貴,不利于廣泛應(yīng)用。氣流吹掃微萃取法(GP-MSE)萃取揮發(fā)性成分具有快速(≤2 min),溶劑用量少且完全萃取等優(yōu)點(diǎn)[13-15]。本研究利用GP-MSE對(duì)夏枯草揮發(fā)性成分開(kāi)展系統(tǒng)性研究,建立夏枯草揮發(fā)性成分提取方法,并探討其不同部位之間揮發(fā)性成分的異同,為其能夠更好地在食品、藥品中應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏枯草 2016年8月采自吉林省長(zhǎng)白山;二氯甲烷 色譜純,美國(guó)Fisher。

GC-MS plus 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津;氣流吹掃微萃取儀 實(shí)驗(yàn)室自行研制;100 μL襯管 安捷倫科技有限公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將新鮮夏枯草按根、枝、葉、花四部位對(duì)其進(jìn)行剪裁,洗凈后置于陰涼通風(fēng)處自然陰干。利用FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)將干燥的夏枯草粉碎,并過(guò)200目篩,隨后置于棕色樣品瓶,-20 ℃存儲(chǔ),備用。

1.2.2 GP-MSE法揮發(fā)性成分的萃取 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-15],具體步驟如下:準(zhǔn)確稱取夏枯草粉末樣品5.0 mg,并置于樣品槽中,隨后安裝氣流吹掃微萃取儀;量取萃取溶劑二氯甲烷(50 μL)置于100 μL襯管(接收器)中;打開(kāi)氣流吹掃微萃取儀開(kāi)關(guān)開(kāi)始萃取;萃取后,利用二氯甲烷定容至100 μL,從中取2 μL進(jìn)樣分析。氣流吹掃微萃取儀參數(shù)如下:氮?dú)饬魉贋? mL/min,萃取溫度為250 ℃,萃取時(shí)間為2 min,冷凝溫度為-4 ℃。

1.2.3 GC-MS分析 GC條件:DB-5 MS毛細(xì)石英柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)被用于揮發(fā)油的分離,升溫程序:45 ℃保持1 min,4 ℃/min升至250 ℃,6 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。載氣He(純度≥99.99%),載氣(He)流速為0.98 mL/min。進(jìn)樣口溫度280 ℃,進(jìn)樣量 2 μL,分流比50∶1。

MS條件:離子源EI,電子能量70 eV,離子源溫度200 ℃,質(zhì)譜接口溫度200 ℃,掃描范圍50～600 m/z,標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)為NISTO8、NISTO8s譜庫(kù)。

定性定量方法:計(jì)算機(jī)檢索譜庫(kù)和人工分析質(zhì)譜圖完成揮發(fā)性成分的定性;借助手動(dòng)積分法,以峰面積歸一化方法完成各組分的定量,計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

定性分析采用島津GC-MS化學(xué)工作站NIST 10標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索完成,并與文獻(xiàn)資料中圖譜解析結(jié)果進(jìn)行比較。定量分析利用手動(dòng)積分方法對(duì)信噪比大于10的所有色譜峰進(jìn)行積分,按面積歸一化法計(jì)算出各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

利用SPSS Statistics軟件中主成分分析(PCA)方法完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 夏枯草中揮發(fā)性成分分析

夏枯草根、枝、葉、花中共檢測(cè)到182個(gè)色譜峰,總離子流圖見(jiàn)圖1。每個(gè)部位檢測(cè)到的揮發(fā)性成分分別為98、98、98、124個(gè),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)搜索定性組分各占總成分的66.53%、91.24%、89.32%和84.87%,夏枯草共定性145個(gè)成分,詳細(xì)見(jiàn)表1。結(jié)果顯示:根中含量最多的是正二十六烷(9.53%)、糠醛(9.12%)和二十八烷(5.77%);葉中主要含有3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇(18.61%)和糠醛(10.74%);枝中以糠醛(9.99%)和2-呋喃甲醇(8.12%)為主要成分;花中以正二十九烷(16.05%)、香豆素(7.79%)和糠醛(5.48%)為主要成分。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)根、枝、葉、花中共有成分有37種,根中含量最多的是糠醛(9.12%)和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(3.61%);葉中主要含有糠醛(10.74%)和2-呋喃甲醇(4.16%);枝中以糠醛(9.99%)和2-呋喃甲醇(8.12%)為主要成分;花中以香豆素(7.79%)和糠醛(5.48%)為主要成分。此外,還檢測(cè)到一些特有化學(xué)成分,如根特有成分17種,其中含量最高的為正二十八烷(5.77%);枝特有成分10種,其中含量最高的為亞油酸(4.52%)和5-乙酰氧基甲基-2-呋喃醛(1.46%),其他均小于1.00%;葉特有成分3種,且百分含量均小于0.2%;花特有成分8種,以正二十九烷(16.05%)含量最高,其他百分含量均小于0.4%。

圖1 夏枯草不同部位揮發(fā)性成分總離子流程圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components in different parts of Prunella vulgaris

表1 夏枯草不同部位揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components from different parts of Prunella vulgaris

續(xù)表

續(xù)表

按不同官能團(tuán)比較分析通過(guò)定性分析發(fā)現(xiàn)所有揮發(fā)性成分都是C4～C36的化合物,包含酯類、醇類、醛類、酮類、酚類、烴類等。為了確定各部位主要貢獻(xiàn)成分的類型,依據(jù)官能團(tuán)的種類將所有揮發(fā)性成分進(jìn)行分類,共分為10類。從表2可知,根中所含主要化合物的類型有醛類(20.66%)和酚類(13.23%),醛類中糠醛(9.12%)占絕對(duì)主導(dǎo)。葉中主要含有醇類(26.79%)和醛類(15.15%),其次酸類(9.66%)和酚類(8.07%),醇類以3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇(18.61%)為絕對(duì)主要成分,醛類以糠醛(10.74%)為主要貢獻(xiàn)成分。枝中主要含有醛類(21.18%)和酚類(19.80%),而酮(13.83%)、醇(11.55%)、酸(9.39%)三類相差不多,醛類中糠醛為絕對(duì)主導(dǎo)成分,相對(duì)含量達(dá)9.99%,酚類以4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚(3.02%)和苯酚(2.42%)為主要成分?；ㄖ泻孔疃嗟某煞质峭闊N類(29.01%),其次是其他含氮和氧化合物(12.17%)、醇類(9.89%)和醛類(8.89%),烴類中正二十九烷(16.05%)為絕對(duì)主導(dǎo)成分。從表中可看出夏枯草根、枝揮發(fā)性物質(zhì)的組成類似,葉、花中揮發(fā)性物質(zhì)的組成與根和枝中的成分存在一定的差異。通過(guò)分析比較,發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同部位揮發(fā)性成分中共同含有化學(xué)成分37種,其他還有一些特有成分。

表2 夏枯草不同部位各類官能團(tuán)揮發(fā)性成分含量(%)Table 2 Functional groups of volatile components content in different parts of Prunella vulgaris(%)

2.2 按所有成分PCA分析

總離子流圖顯示夏枯草各部位均存在多種揮發(fā)性成分,但難以通過(guò)色譜圖直觀區(qū)分各部位成分的差異(圖2)。全部成分定性定量后,從成分及含量表中仍難以直觀區(qū)分四個(gè)部位。為此,本文借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行比較分析。

為了直觀、準(zhǔn)確判斷夏枯草不同部位間的化學(xué)成分是否存在實(shí)質(zhì)性差異,利用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行比較,本文采用主成分分析法(PCA),分別以所有成分及官能團(tuán)分類數(shù)據(jù)作為變量,具體結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。在圖2中第一個(gè)主成分(X-axis:PC1)占79.9%,第二個(gè)主成分(Y-axis:PC2)占13.8%。在圖3中第一個(gè)主成分(X-axis:PC1)占55.3%,第二個(gè)主成分(Y-axis:PC2)占26.8%。兩種作圖方式中第一和第二主成分之和均大于80%。從圖3中可直觀判斷每個(gè)部位的主要成分類型,比如根中主要是醛類和酚類;枝中主要是醛類、酚類、醇類和酮類;葉中主要是醇類和醛類;花中主要是烷烴類和其他(含N,O)類。圖2和圖3均可直觀顯示夏枯草揮發(fā)性成分在根和枝中差異很小,葉與根枝在成分上存在一定差異,主要是由于醇類物質(zhì)引起的,而花中揮發(fā)性成分與其他部分存在明顯差異,主要貢獻(xiàn)成分也有很大不同。該研究結(jié)果顯示,復(fù)雜的化學(xué)成分可利用統(tǒng)計(jì)分析方法將其簡(jiǎn)單化,進(jìn)而為深入研究奠定基礎(chǔ)。

圖2 所有成分主成分分析圖Fig.2 PCA diagram of all components

圖3 全部成分的官能團(tuán)分類主成分分析圖Fig.3 PCA diagram of functional group classification of all components

3 結(jié)論

本文利用氣流吹掃微萃取技術(shù)和GC-MS聯(lián)用的方法對(duì)夏枯草不同部位揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量分析,結(jié)果顯示,共定性145種成分,其中有28種是根、枝、葉、花中共有的成分。根中含量最多的是正二十六烷(9.53%)、糠醛(9.12%)和二十八烷(5.77%);葉中主要含有3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇(18.61%)和糠醛(10.74%);枝以糠醛(9.99%)和2-呋喃甲醇(8.12%)為主要成分;花中以正二十九烷(16.05%)、香豆素(7.79%)和糠醛(5.48%)為主要成分。該方法能夠定性更多的揮發(fā)性成分,進(jìn)而為夏枯草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。本文借助主成分分析法使分析結(jié)果更直觀。本文深入研究了夏枯草不同部位間揮發(fā)性成分的差異,為夏枯草在食品、藥品等領(lǐng)域應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。