吳迪迪,李勇勇,史詠梅,王 焙,張登科,婁永江

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315211)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚之一,因其味道鮮美,富含營(yíng)養(yǎng)成分而深受大眾歡迎[1]。由于新鮮大黃魚含有較高的蛋白質(zhì)和水分,極易腐敗變質(zhì)。目前關(guān)于大黃魚的保鮮方法主要有輻照保鮮[2]、超高壓保鮮[3]、氣調(diào)保鮮[4-5]、復(fù)合保鮮[6]等,但因?yàn)槊媾R技術(shù)不成熟及商業(yè)成本高等問題還不能完全普及。冰藏保鮮[5,7-8]是常見的保鮮方法,但大黃魚的肌肉易被腐敗微生物侵染而腐敗變質(zhì)[9]。二氧化氯(Chlorine Dioxide,ClO2)作為一種新型的保鮮介質(zhì),對(duì)水體中傳播的病原微生物、病毒、芽孢都有極強(qiáng)的殺滅作用[10],且具有安全無(wú)殘留,效率高、副產(chǎn)物少、成本低等優(yōu)點(diǎn),是目前國(guó)際上公認(rèn)的高效殺菌劑和食品保鮮劑[11],研究表明ClO2對(duì)微生物的細(xì)胞壁有較好的透過和吸附性能,控制微生物蛋白質(zhì)的合成,并使蛋白質(zhì)中的部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應(yīng),使氨基酸分解破壞,最終導(dǎo)致微生物死亡[12]。目前,國(guó)內(nèi)ClO2在果蔬保鮮方面有較多研究[13-14],但研究ClO2對(duì)大黃魚肌肉保鮮處理的報(bào)道甚少。

本研究選取大黃魚肌肉作為原材料,以三種不同的保鮮方式進(jìn)行保鮮處理,測(cè)定其微生物變化和品質(zhì)特性,并利用高通量測(cè)序技術(shù)分析大黃魚肌肉的腐敗菌,旨在進(jìn)一步提高大黃魚的肌肉品質(zhì),延長(zhǎng)產(chǎn)品保藏期,為穩(wěn)定型ClO2冰對(duì)大黃魚肌肉的保鮮產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚 購(gòu)于浙江寧波路林市場(chǎng)的閩粵東族養(yǎng)殖大黃魚,選取表皮光澤無(wú)損傷,魚鱗完整并有少量透明粘液,個(gè)體均勻,重量約為(450±50) g/條的鮮活大黃魚；ClO2試劑(A試劑、B試劑) 純歐德公司;基因組DNA抽提試劑盒系列 上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司;Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒 上海斯信生物科技有限公司;Taq DNA聚合酶 賽默飛世爾科技公司;MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

A96FS70TI型變頻冰箱 德國(guó)Siemens股份有限公司;TX-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)SMS公司;PEN3型電子鼻 德國(guó)Airsense公司;Pico-21臺(tái)式離心機(jī)Thermo Fisher;凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP;Q32866 Qubit? 2.0熒光計(jì) Invitrogen;T100TM Thermal Cyeler PCR儀 BIO-RAD。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ClO2冰的制備 參照純歐德ClO2試劑說明書,配制濃度為300 mg/L的高濃度的ClO2溶液,將稀釋至5 mg/L的溶液置于制冰機(jī)中,制備大小約為(0.75±0.25) cm3的穩(wěn)定型ClO2碎冰。

1.2.2 保鮮處理 活體大黃魚載氧運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后,放在冰水中30 min冷卻致死后隨機(jī)分成三組,冷藏保鮮(CK組):大黃魚裝入帶孔泡沫箱后置于0～4 ℃環(huán)境下;冰藏保鮮(IC組):大黃魚裝入帶孔泡沫箱后加入普通碎冰覆蓋,置于0 ℃～4 ℃環(huán)境下;冰藏聯(lián)用ClO2保鮮(CD組):大黃魚裝入帶孔泡沫箱后加入ClO2碎冰覆蓋,置于0 ℃～4 ℃環(huán)境下,不同組碎冰覆蓋厚度均為(3.0±0.5) cm,每隔24 h補(bǔ)充一次碎冰。選取大黃魚背部肌肉去鱗、去皮進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定,并在第0、1、3、5、9、13、17、21 d進(jìn)行樣品測(cè)定分析。

1.2.3 高通量測(cè)序鑒定

1.2.3.1 樣品預(yù)處理 參照文獻(xiàn)[15-16],將不同處理組的大黃魚放入滅菌泡沫盒中0～4 ℃條件下保藏7 d后各取肌肉200 mg。將樣品放入2 mL離心管中,加入70%乙醇溶液1 mL,振蕩,離心(10000 r/min,3 min),移去上層液體。加入1×PBS溶液,振蕩混勻并再次離心(10000 r/min,3 min),之后移去上層液體。將2 mL離心管倒置于吸水紙上1 min至無(wú)液體流出為止。離心管于55 ℃烘箱直至殘留酒精完全揮發(fā)。

1.2.3.2 宏基因組DNA的提取 采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒(OMEGA公司)提取總DNA,并用凝膠電泳(濃度為1%瓊脂糖)對(duì)所提取總DNA的完整性進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)濃度采用超微量分光光度計(jì)(ThermoNanoDrop 2000)。將檢測(cè)合格的總DNA于-20 ℃條件下保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序 經(jīng)PCR擴(kuò)增,使用Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行基因組DNA精確定量。用于PCR擴(kuò)增的引物與Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物已經(jīng)融合,341F引物:CCCTACA CGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNG GCWGCAG;805R引物:GACTGGAGTTCCTTGGCAC CCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC。

經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增完成接頭序列的連接。PCR結(jié)束后,先利用瓊脂糖進(jìn)行電泳鑒定,之后再進(jìn)行DNA純化回收。使用Qubit 2.0 DNA測(cè)定試劑盒精確定量回收的DNA,以便以1∶1的等量混勻后進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)樣品等量混合后的DNA量取10 ng,最終上機(jī)時(shí)測(cè)序濃度為20 pmol。

1.2.4 菌落總數(shù) 依據(jù)GB 4789.2-2016菌落總數(shù)的測(cè)定。

1.2.5 pH 依據(jù)GB 5009.237-2016食品中pH的測(cè)定。

1.2.6 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定 參考廖媛媛等[17]的操作方法略作修改,將三組大黃魚室溫下解凍20 min切取背部肌肉2.5 cm×2.5 cm×1.5 cm的無(wú)刺樣品,用TX-XT plus質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。探頭選用直徑為5 cm的圓柱形探頭。壓縮探針?biāo)俣葹? mm/s,測(cè)試壓縮比為50%,平行測(cè)定6次。

1.2.7 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N) 按照GB 5009.228-2016方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.8 TBARS的測(cè)定 參考馬麗珍等[18]的操作方法略作修改,稱取10.0 g背部肌肉研細(xì)后,置于100 mL的加蓋錐形瓶中,加入50 mL 7.5%的三氯乙酸(含 0.1% EDTA),混勻后,室溫放置30 min,浸漬液用雙層濾紙過濾。濾液重復(fù)用雙層濾紙過濾一次。取5 mL濾液加入25 mL離心管中,加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液,在90 ℃水浴40 min。

之后流水冷卻。再加入5 mL氯仿并搖勻。分層后取上清液分別在532 nm和600 nm處比色。記錄吸光度值并用以下公式計(jì)算TBARS值。

與TBARS反應(yīng)的物質(zhì)的量(TBARS)單位表示為mg·MA/kg。

1.2.9 電子鼻檢測(cè) 參考楊茗媛等[19]的操作方法略作修改,將不同處理組的大黃魚肌肉解剖,取背部同一部位肌肉0.50 g于10 mL頂空瓶中,加蓋密封,放入4 ℃樣品盤待檢,樣品平衡時(shí)間20 min,平衡溫度35 ℃,取樣體積3 mL;進(jìn)樣速度25 mL/s,進(jìn)樣口溫度45 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 8.5及Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,數(shù)據(jù)結(jié)果均以“mean±SD”來(lái)表示,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。同一列中的不同小寫字母表示顯著差異(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對(duì)大黃魚肌肉貯藏期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由表1可以看出,CK組中的腐敗菌是希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、冷桿菌屬、摩根氏菌屬、氣單胞菌屬。在IC組中,希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、冷桿菌屬是優(yōu)勢(shì)菌,而在CD組中,僅有希瓦氏菌屬和假單胞菌屬是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。Ge等[20]研究腐敗大黃魚肌肉中分離出10株菌,其中8株產(chǎn)生H2S的菌株與希瓦氏菌屬密切相關(guān),另外的兩株分離株分別被鑒定為熒光假單胞菌和P.fragi。加冰處理對(duì)摩根氏菌屬、弧菌屬與類香味菌屬有明顯的抑制效果,可能由于加冰處理抑制了嗜熱微生物的生長(zhǎng)。但ClO2處理后大黃魚肌肉中的菌屬種類均顯著降低,由于ClO2分子外層具有一對(duì)未成對(duì)的活潑的自由電子,具有很強(qiáng)的氧化能力,破壞微生物的結(jié)構(gòu),從而改變微生物菌群結(jié)構(gòu)及造成數(shù)量降低[21]。

表1 基于屬水平上樣本主要rank reads數(shù)目Table 1 Number of major rank reads of the sample at the genus level

2.2 不同處理方式對(duì)大黃魚肌肉菌落總數(shù)的影響

圖1表明,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),各組菌落總數(shù)均呈上升趨勢(shì)。IC組前期上升趨勢(shì)較CK組不顯著(p>0.05),后期上升趨勢(shì)有顯著差異(p<0.05)。從貯藏效果來(lái)看,CD組>IC組>CK組,說明ClO2冰殺菌及抑制細(xì)菌增長(zhǎng)繁殖的效果優(yōu)于普通冰。ClO2分子外層具有一對(duì)未成對(duì)的活潑的自由電子,具有很強(qiáng)的氧化能力,可以使微生物中含有的蛋白質(zhì)(酶)中氨基酸間的鏈氧化斷裂,使蛋白質(zhì)失去活性,阻止細(xì)胞再生[22-23]。季曉彤等[24]研究也證明了ClO2可以起到殺菌并延長(zhǎng)貨架期的作用。

圖1 不同處理組對(duì)大黃魚肌肉菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of different treatment groups on the total number of large yellow croaker colonies注:不同處理組同一天不同小寫字母 表示差異顯著；圖2～圖5同。

2.3 不同處理方式對(duì)大黃魚肌肉pH的影響

圖2結(jié)果所示,在貯藏過程中,每組的pH呈先下降后上升趨勢(shì)。其中,CD組與前兩組比較有顯著性差異(p<0.05)。貯藏初期,魚體經(jīng)歷僵硬、自溶兩個(gè)過程中,僵硬期微生物使糖原和ATP分解產(chǎn)生乳酸、磷酸,使肌肉組織酸性增強(qiáng),導(dǎo)致pH下降,自溶期pH開始升高,由于肌肉中大量蛋白質(zhì)分解為氨基酸和可溶性含氮物,這為微生物的繁殖提供了條件[25]。pH下降后又開始緩慢上升是由于肌肉內(nèi)源性及微生物來(lái)源蛋白酶降解氨基酸產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)所致[23-24]。CD組的pH下降緩慢,ClO2具可以抑制蛋白質(zhì)(酶)中的氨基酸鏈發(fā)生斷裂,從而使蛋白質(zhì)失去活性,最終使糖原和ATP分解產(chǎn)酸量減少[26]。同時(shí),ClO2處理后下降緩慢是由于微生物中的外源性蛋白酶失去活性,進(jìn)一步抑制體系中產(chǎn)胺微生物的滋生,從而降低自溶程度,使pH上升緩慢[27]。

圖2 不同處理組對(duì)大黃魚肌肉pH的影響Fig.2 Effect of different treatment groups on pH of large yellow croaker

2.4 不同處理方式對(duì)大黃魚肌肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

圖3結(jié)果表明,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),CD組相比較CK組和IC組的硬度(A圖)、彈性(B圖)、咀嚼性(C圖)均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),在貯藏3 d后CD組下降速度較CK組和IC組緩慢,出現(xiàn)顯著差異(p<0.05)。由于養(yǎng)殖大黃魚在死后,進(jìn)入了僵硬期,肌肉的質(zhì)地特性受蛋白質(zhì)、水分、脂肪含量的影響,貯藏期間,肌肉的水分含量逐漸減少,脂肪和蛋白質(zhì)逐漸被氧化和分解[28];隨后由于內(nèi)源蛋白酶和腐敗微生物的降解導(dǎo)致蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,繼而導(dǎo)致硬度、彈性、咀嚼性等等指標(biāo)下降[29-30]。結(jié)果中CD組樣品的質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于CK組樣品,這是由于樣品經(jīng)過ClO2處理后對(duì)微生物的抑制作用較強(qiáng),微生物無(wú)法通過生物活性與代謝活動(dòng)對(duì)大黃魚肌肉的蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響[31];同時(shí),冰藏的處理方式使樣品迅速降溫,抑制其組織內(nèi)部酶的活性及細(xì)胞的代謝,從而起到保持蛋白質(zhì)特性的目的。

圖3 不同處理組對(duì)大黃魚肌肉質(zhì)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of different treatment groups on the texture of large yellow croaker

2.5 不同處理方式對(duì)大黃魚肌肉TVB-N的影響

從圖4中可知,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),不同處理組的TVB-N值均呈上升趨勢(shì)且差異顯著(p<0.05)。在貯藏期間,IC組和CD組樣品的TVB-N值上升趨勢(shì)低于CK組。研究表明普通冰和ClO2可以抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖并降低內(nèi)源酶的作用,從而延緩蛋白質(zhì)的分解,降低魚肉的腐敗程度[32]。CD組相比于IC組能夠較好地抑制TVB-N值的上升,由于ClO2通過使微生物蛋白質(zhì)失活達(dá)到殺菌目的,有利于降低TVB-N的生成速率,表明ClO2可以有效抑制微生物的生長(zhǎng)[24,26]。

圖4 不同處理組對(duì)大黃魚肌肉TVB-N的影響Fig.4 Effects of different treatment groups on TVB-N of large yellow croaker

2.6 不同處理方式對(duì)大黃魚肌肉TBARS值的影響

TBARS是評(píng)估脂質(zhì)氧化程度的重要參考指標(biāo),TBARS值與反應(yīng)中產(chǎn)生的醛、酮等小分子物質(zhì)成正比,說明TBARS值越大,其脂質(zhì)氧化程度越高[33-34]。圖5表明不同處理組對(duì)養(yǎng)殖大黃魚肌肉的TBARS值的影響,貯藏初期新鮮大黃魚肌肉的TBARS值為0.26 mg/100 g左右。貯藏前期,CD組的TBARS值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)且較CK組和IC組差異極顯著(p<0.0001),說明氧化程度嚴(yán)重;其中,貯藏初期IC組大黃魚肌肉的TBARS值上升速率低于CK組。貯藏前期冰藏聯(lián)用ClO2處理組上升較快,可能由于ClO2具有強(qiáng)氧化性,使脂肪氧化成丙二醛(MDA),隨后ClO2進(jìn)一步將醛類物質(zhì)氧化為羧酸[35],使TBARS含量下降。楊賢慶等[31]研究不同濃度的ClO2對(duì)羅非魚魚丸的TBARS值有較好的抑制效果,且低濃度的ClO2就能有較好的抑制效果,與本研究結(jié)果一致。

圖5 不同處理組對(duì)大黃魚肌肉TBARS值的影響Fig.5 Effects of different treatment groups on TBARS values of large yellow croaker

2.7 不同處理方式對(duì)大黃魚肌肉氣味變化的影響

電子鼻可以靈敏地檢測(cè)到不同大黃魚肌肉氣味的變化,利用電子鼻作為完善食品在保藏期間氣味變化的衡量標(biāo)準(zhǔn)[36],可以更準(zhǔn)確直觀的反應(yīng)大黃魚肌肉品質(zhì)變化及腐敗程度,避免主觀因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響。圖6通過執(zhí)行載荷分析來(lái)消除冗余傳感器,根據(jù)分析,傳感器S2(氮氧化物)、S6(甲烷)、S7(無(wú)機(jī)硫化物)和S9(芳香成分,有機(jī)硫化物)對(duì)大黃魚背部肌肉具有較高的響應(yīng)值,與前人研究結(jié)果相似[19]。腐敗希瓦氏菌是一種典型的冷藏海魚腐敗菌,具有較強(qiáng)的腐敗活性,可產(chǎn)生H2S,還原TMAO等物質(zhì);假單胞菌可以產(chǎn)生大量的醛、酮和酯類等物質(zhì)[37-39]。圖7表示不同處理?xiàng)l件下養(yǎng)殖大黃魚背部肌肉電子鼻PCA分析結(jié)果,每個(gè)橢圓代表不同處理組,橢圓分布距離越遠(yuǎn),說明氣味差異性越大[19]。圖7的PC1、PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為92.47%、5.17%,PC1、PC2的總貢獻(xiàn)率為97.64%。CK組、IC組、CD組分別在貯藏5 d、9 d、17 d后的橢圓距離新鮮樣品(0 d)較遠(yuǎn),這與菌落總數(shù)和TVB-N值一致,表明肌肉接近腐敗的終點(diǎn)。由于PC2的方差貢獻(xiàn)率為5.17%,說明ClO2對(duì)于大黃魚肌肉貢獻(xiàn)率影響不大,說明其貢獻(xiàn)率主要源于微生物腐敗以及蛋白質(zhì)自溶。

圖6 電子鼻傳感器對(duì)大黃魚肌肉背部肉響應(yīng)值載荷分析Fig.6 Load analysis of response value ofelectronic nose sensor to cultured Pseudosciaena crocea

圖7 ClO2冰對(duì)大黃魚肌肉背部肉電子鼻數(shù)據(jù)PCA圖Fig.7 PCA diagram of chlorine nose ice on the back of meat of large yellow croaker

3 結(jié)論

通過高通量測(cè)序分析表明冰藏聯(lián)用ClO2處理能降低菌落總數(shù),改變菌相組成。大黃魚肌肉經(jīng)過ClO2冰處理后,其TVB-N值、TBARS值、硬度、咀嚼性、彈性和pH等理化指標(biāo)相較于冰藏保鮮變化較為小,表明ClO2冰可以使大黃魚肌肉保持較好的理化品質(zhì),并延長(zhǎng)其貨架期。同時(shí),從氣味變化可以看出,肌肉經(jīng)ClO2冰處理后,不僅減少其品質(zhì)劣變而且又不影響大黃魚肌肉本身的風(fēng)味。