高永芳，宮玉霞，楊雅媛，韓 玲,*，余群力,*，朱躍明，韓廣星，薄文喜

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘南藏族自治州畜牧工作站，甘肅 甘南 747000；3.張掖市萬(wàn)禾草畜產(chǎn)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司，甘肅 張掖 734000；4.國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系臨沂站，山東 臨沂 276000；5.河北福成五豐食品股份有限公司，河北 廊坊 065201）

宰后肌肉轉(zhuǎn)化為肉需要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生理生化過(guò)程，其中能量代謝尤其是糖酵解是這些變化過(guò)程的重要途徑[1]，而糖酵解與肉色、pH值、嫩度及保水性等肉質(zhì)性狀密切相關(guān)，因此，能夠調(diào)節(jié)宰后糖酵解進(jìn)程并影響肌肉品質(zhì)的單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）無(wú)疑是一個(gè)有效的研究靶點(diǎn)。AMPK是能被AMP激活的蛋白激酶，由一個(gè)催化亞基α和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基β、γ共同構(gòu)成，編碼每個(gè)亞基的基因不同，α亞基有α1和α2兩種異構(gòu)體，分別被PRKAA1、PRKAA2基因編碼，其Thr（172）磷酸化是AMPK激活的必要條件[2]。屠宰后胴體血液循環(huán)及供氧中斷，肌肉進(jìn)行無(wú)氧酵解產(chǎn)生能量，生成的ATP含量減少，同時(shí)肌肉中ATP消耗繼續(xù)導(dǎo)致AMP/ATP的比值增加，這種能量狀態(tài)激活A(yù)MPK[3]，活化后的AMPK通過(guò)抑制糖原合成代謝等途徑以減少ATP的消耗，同時(shí)促進(jìn)糖酵解、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑增加ATP的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)機(jī)體能量供求平衡，是調(diào)控能量代謝的開關(guān)。

5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（5-a m i n o-4-imidazolecarboxamide，AICAR）是可透過(guò)細(xì)胞膜的AMPK專一性激活劑，可磷酸化為5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸，5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸作為AMP模擬物激活A(yù)MPK的同時(shí)提高宰后糖酵解水平[4]。然而，在牛肉宰后成熟過(guò)程中，AICAR是否通過(guò)提高AMPKα基因mRNA轉(zhuǎn)錄量進(jìn)而提高糖酵解水平，同時(shí)對(duì)宰后肌肉內(nèi)環(huán)境及肉品質(zhì)造成影響的研究，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。Young等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK激活劑AICAR能夠激活大鼠骨骼肌糖原磷酸化酶加速糖原分解；Park等[6]研究發(fā)現(xiàn)AICAR激活A(yù)MPK會(huì)使肌肉呈現(xiàn)更快速收縮，更具糖酵解性質(zhì)；有研究指出AMPK活性變化與不同極限pH值牛肉的產(chǎn)生密切相關(guān)[7-10]。以上研究均表明AMPK活性受多種方式的調(diào)控，因此可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK活性，以降低動(dòng)物的宰前應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步改善肉的品質(zhì)，降低異質(zhì)肉的發(fā)生率，這對(duì)牛肉品質(zhì)的改善具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以0.50 mol/L AICAR處理的西雜牛背最長(zhǎng)肌為對(duì)象，通過(guò)測(cè)定牛肉宰后成熟過(guò)程中AMPK活性、AMPKα基因mRNA及P-AMPK表達(dá)量、糖酵解水平、肌肉內(nèi)環(huán)境和品質(zhì)指標(biāo)的變化，研究AICAR處理對(duì)宰后肌肉AMPK的激活作用及對(duì)糖酵解、肌肉內(nèi)環(huán)境及肉品質(zhì)的影響，為深入研究AMPK活性與宰后肌肉糖酵解、肌肉內(nèi)環(huán)境及品質(zhì)的關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)調(diào)控宰后肌肉品質(zhì)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取甘肅省張掖地區(qū)（海拔1 400 m左右）同一牧場(chǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育正常、健康無(wú)病、公母各半、體質(zhì)量相近（公牛（600±50）kg、母牛（450±60）kg）、年齡2～4 歲的西雜牛（西門塔爾公?！帘镜攸S牛）10 頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h，屠宰放血后立即取牛胴體中部背最長(zhǎng)肌肉樣備用。

AICAR、RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix ExTaqTMII、pMD?19-TVector Kit 大連寶生物工程有限公司；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（P-AMPK）ELISA試劑盒、己糖激酶、乳酸、糖原游離葡萄糖、能量因子含量測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-E型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；CFX96TM實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；PCR擴(kuò)增儀 北京賽默飛科技有限公司；JSM-5600LV低真空掃描電子顯微鏡儀 英國(guó)牛津儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集和制備

以上述背最長(zhǎng)肌為試材，去除表面脂肪及結(jié)締組織后，分割為每塊約250 g的肉樣，按照肉液比10∶1（m/V）將0.50 mol/L AICAR溶液均勻注射進(jìn)肉塊中，以不作任何處理的肉樣為對(duì)照組，采用托盤包裝，隨后立即取約40 g肉樣分裝并投入液氮中作為0 h肉樣，剩余肉樣置于0～4 ℃下成熟。

在成熟時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定pH值、肉色及蒸煮損失等指標(biāo)，對(duì)于肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）、AMPK活性等不便立即測(cè)定的指標(biāo)，將肉樣用鋁箔紙包裹，置于－80 ℃凍藏待測(cè)。

刺殺放血后立即取背最長(zhǎng)肌切成約100 mg的肉塊，立即放入滅酶滅菌凍存管中，置于液氮中速凍后于－80 ℃凍藏，用于AMPKα基因表達(dá)量及P-AMPK免疫沉淀的測(cè)定。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 引物序列來(lái)源及合成

參照田萬(wàn)強(qiáng)[11]的設(shè)計(jì)方法。以β-actin為內(nèi)參基因，參照GenBank收錄的β-actin、PRKAA1、PRKAA2基因的mRNA序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件和Oligo軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列及PCR參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters used for quantitative real-time PCR

1.3.2.2 總RNA的提取

依據(jù)RNAiso Plus的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)使用說(shuō)明書提取肌肉總RNA[12]。用超微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。將質(zhì)量較高的RNA立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA儲(chǔ)存于－20 ℃或直接于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

總RNA采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒提取。采用SYBR Premix ExTaqTMII，pMD?19-TVector Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本分別用待檢測(cè)基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)做3 個(gè)重復(fù)[13]。其中95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，40 次循環(huán)。

1.3.2.4 相對(duì)基因表達(dá)量的計(jì)算

采用2－??Ct計(jì)算法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)算方法如式（1）、（2）[14]所示。

1.3.3 蛋白免疫印跡

取肉樣100 mg，按1∶10（m/V）加入預(yù)冷的勻漿緩沖液，冰浴勻漿。將勻漿液倒入1.5 mL EP管中，靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后存于－80 ℃保存待測(cè)。將1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別配制為0、10、20、40、60、80、100 μg/mL，加入5 mL Bradford工作液，混勻后靜置5 min，根據(jù)蛋白質(zhì)量濃度確定上樣體積。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上（濕轉(zhuǎn)），然后分別用非標(biāo)記一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。顯色及成像：按體積比1∶1混合增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒中兩種液體，將上述混合液均勻鋪在聚偏氟乙烯膜表面，室溫作用4 min。抖掉膜上液體，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.3.4 AMPK活性測(cè)定

參考Underwood等[15]的方法，取肉樣約0.6 g，放入預(yù)冷的離心管中，按照1∶5（m/V）加入冷凍勻漿液，在3 000 r/min冰浴勻漿。然后4 ℃、12 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液測(cè)定。具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.5 糖酵解指標(biāo)的測(cè)定

用蒸餾水沖洗肉樣表面血漬，并用濾紙吸干殘留水分后將pH計(jì)的探頭插入肉樣，使pH計(jì)電極與肌肉充分接觸，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄，每個(gè)肉樣隨機(jī)選擇3 個(gè)不同的部位重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

肌糖原、乳酸、游離葡萄糖含量采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，取2.0 g肉樣，加入8 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）勻漿后3 000 r/min離心20 min，收集上清液，之后進(jìn)行加樣、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止等步驟，具體操作和結(jié)果計(jì)算參照各試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.6 能量代謝指標(biāo)的測(cè)定

樣品前處理方法如上述肌糖原測(cè)定步驟，參照ATP、ADP、AMP、IMP試劑盒說(shuō)明書測(cè)定其含量，用雙縮脲法測(cè)定樣品的蛋白含量。

1.3.7 肉品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.3.7.1 肉色測(cè)定

使用TC-P2A全自動(dòng)色差計(jì)，先將儀器預(yù)熱30 min后用校正板校準(zhǔn)。在肉樣表面取3 個(gè)不同的點(diǎn)測(cè)定L*、a*和b*值，分別取其平均值。

1.3.7.2 蒸煮損失率測(cè)定

參考H o l m a n等[16]的方法。取體積不小于6 cm×3 cm×3 cm的肉樣，去除表面脂肪，稱質(zhì)量（m1）后放入蒸煮袋中，置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱，當(dāng)肉樣中心溫度升至70 ℃時(shí)取出冷卻至室溫后稱質(zhì)量（m2），按公式（3）計(jì)算蒸煮損失率。

1.3.7.3 剪切力測(cè)定

將肉樣沿肌纖維方向取3 個(gè)直徑為1.27 cm肉柱，用C-LM4型嫩度儀垂直肌纖維方向剪切肉柱，并記錄剪切力。

1.3.7.4 MFI測(cè)定

參考Wang Linlin等[17]的方法。取4.0 g肉樣，加入40 mL MFI分離液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L CaCl2，pH 7.0），勻漿后4 500 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀重復(fù)上述步驟，沉淀再用20 mL分離液溶解后用紗布過(guò)濾。將濾液的蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，立即在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，MFI即所得吸光度乘以200。

1.3.7.5 掃描電子顯微鏡觀察

將肉樣切成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的肉塊，于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定3 d，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.3）清洗數(shù)次，然后用乙醇梯度脫水，抽真空干燥，噴金后于掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓為20 kV，放大倍數(shù)為300。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin 9.0軟件繪圖，SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析；采用Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA純度檢測(cè)

圖1 肉樣總RNA電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis of total RNA from meat samples

用超微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總樣品RNA，OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，條帶清晰，無(wú)條帶彌散現(xiàn)象，表明提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于后期實(shí)驗(yàn)。

2.2 PRKAA1、PRKAA2 mRNA表達(dá)量分析結(jié)果

圖2 PRKAA1、PRKAA2基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative expression levels of PRKAA1 and PRKAA2 genes

PRKAA1和PRKAA2是編碼蛋白基因，能在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)。如圖2所示，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組PRKAA1、PRKAA2相對(duì)表達(dá)量均呈先升后降的趨勢(shì)，AICAR組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明AICAR提高了PRKAA1、PRKAA2表達(dá)量。Thaler等[18]研究的AICAR處理小鼠白肌纖維能夠提高AMPKα2表達(dá)量（P＜0.05），而AMPKα2能夠磷酸化失活糖原合成酶，表明AMPK可調(diào)控肌細(xì)胞能量代謝，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；楊燁等[19]研究發(fā)現(xiàn)PRKAA1與快速酵解型肌纖維（IIB）表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，肌肉中IIB占主導(dǎo)會(huì)加速糖酵解進(jìn)程，導(dǎo)致pH值迅速下降，由此推測(cè)PRKAA1與宰后肌肉pH值也存在一定的相關(guān)性。

2.3 P-AMPK免疫印跡分析結(jié)果

圖3 宰后成熟過(guò)程中P-AMPK蛋白免疫結(jié)果Fig. 3 Western blot results of P-AMPK during postmortem aging

由圖3可知，兩組P-AMPK活性均呈先升后降的變化趨勢(shì)，AICAR上調(diào)牛肉宰后成熟過(guò)程中P-AMPK活性（P＜0.05），并在12 h檢測(cè)到最高AMPK活性。成熟0～12 h過(guò)程中，對(duì)照組、AICAR組P-AMPK活性分別提高了38.2%、56.9%，表明AICAR提高了肌肉AMPK活性。

2.4 AMPK活力分析結(jié)果

圖4 宰后成熟過(guò)程中AMPK活力的變化Fig. 4 Change in AMPK activity during postmortem aging

AMPK可調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝平衡，其活性高低可評(píng)判宰后糖酵解的速度和程度[20]。由圖4可知，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組AMPK活力均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，對(duì)照組AMPK活力極顯著低于AICAR組（P＜0.01）。當(dāng)成熟至12 h時(shí)，對(duì)照組和AICAR組AMPK活力分別為138.19、200.69 U/L，與對(duì)照組相比，AICAR組AMPK活力提高了45.23%。成熟至168 h時(shí)，對(duì)照組和AICAR組AMPK活力分別為48.38、70.23 U/L，與對(duì)照組相比，AICAR組AMPK活力提高了45.16%，表明隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)AICAR的激活作用逐漸下降。

2.5 肌肉糖酵解水平分析結(jié)果

pH值是評(píng)價(jià)肉質(zhì)的重要指標(biāo)，宰后肌肉pH值下降速度和程度影響肌肉蛋白特性進(jìn)而對(duì)肉質(zhì)具有重要影響[21]。袁倩等[22]研究表明AMPK活性與不同極限pH值牛肉的產(chǎn)生密切相關(guān)。由表2可知，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組pH值均呈先降后緩慢上升的趨勢(shì)，成熟至72 h，對(duì)照組及AICAR組pH值均下降至最低值5.58、5.45，與對(duì)照組相比，AICAR組pH值降低了0.13，pH值下降速度較對(duì)照組快，表明AICAR加快了糖酵解進(jìn)程，縮短了宰后牛肉成熟時(shí)間，這與Warriss等[23]報(bào)道的AMPK活化可促進(jìn)糖酵解，進(jìn)而影響肌肉pH值一致，說(shuō)明AMPK活性變化能調(diào)節(jié)肌肉pH值。

表2 宰后牛肉成熟過(guò)程中糖酵解指標(biāo)變化Table 2 Changes in glycolysis indexes during postmortem aging

為進(jìn)一步驗(yàn)證AMPK對(duì)宰后糖酵解的影響，對(duì)肌糖原、游離葡萄糖和乳酸含量進(jìn)行測(cè)定。由表2可知，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組肌糖原含量均呈下降趨勢(shì)，宰后24～72 h，AICAR組肌糖原含量顯著低于對(duì)照組，120～168 h，AICAR組肌糖原含量低于對(duì)照組，但差異不顯著，這與Kurth-Kraczek等[24]研究證實(shí)的激活A(yù)MPK可促進(jìn)骨骼肌糖酵解、加速糖原分解基本一致；同時(shí)，宰后成熟期間兩組游離葡萄糖水平差異不顯著，乳酸含量均呈先升后降的變化趨勢(shì)，72 h時(shí)達(dá)到最大值，其中成熟24～168 h過(guò)程中AICAR組乳酸含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.6 肌肉內(nèi)環(huán)境能量指標(biāo)分析結(jié)果

圖5 宰后成熟過(guò)程中能量代謝相關(guān)指標(biāo)的變化Fig. 5 Changes in energy metabolism-related indexes during postmortem aging

宰后成熟期間，ATP消耗增多，而其生成量減少，肌肉缺少能量供應(yīng)，開始失控瓦解，解僵開始[25]。當(dāng)ATP耗盡時(shí)，ADP會(huì)進(jìn)一步釋放能量，產(chǎn)生AMP。由圖5A可知，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和AICAR組ATP含量呈先下降后緩慢上升的變化趨勢(shì)，在宰后72 h分別達(dá)到最小值0.62、1.27 μmol/g，AICAR組比對(duì)照組高0.65 μmol/g，成熟72～168 h過(guò)程中ATP含量緩慢上升，可能是因?yàn)槌墒旌笃贏TP含量減少，AMPK促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)再生成ATP，以維持能量平衡；由圖5B可知，對(duì)照組和AICAR組ADP含量隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，在宰后24 h分別達(dá)到最小值0.88、1.45 μmol/g，與對(duì)照組相比AICAR組增加了0.57 μmol/g；由圖5C可知，兩組AMP含量總體先升后降，且AICAR組AMP含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明AMPK活性升高對(duì)肌肉能量狀態(tài)有重要影響，這與賈青等[26]研究的成熟時(shí)間對(duì)牦牛肌細(xì)胞內(nèi)能量因子變化的影響結(jié)果基本一致；IMP是ATP降解的中間產(chǎn)物，其含量增加有助于肉品風(fēng)味的改善，由圖5D可知，兩組IMP含量呈先升后降趨勢(shì)，其中AICAR組IMP含量極顯著高于對(duì)照組，成熟后期IMP含量下降可能是因?yàn)榇藭r(shí)酸性磷酸酶活化降解IMP，這與Shi Ce等[27]得到的鰱魚宰后IMP含量變化趨勢(shì)基本一致。

2.7 AICAR對(duì)西雜牛肉品質(zhì)的影響

2.7.1 肉色的變化

圖6 宰后成熟過(guò)程中色度的變化Fig. 6 Changes in beef color during postmortem aging

肉色是評(píng)定牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，與肌紅蛋白含量和水分有很大關(guān)系[28]。由圖6可知，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組L*值、a*值、b*值均呈先升后降的變化趨勢(shì)。由圖6A可知，兩組L*值均在72 h達(dá)到最大值，隨后逐漸下降，其中成熟24～72 h過(guò)程中，AICAR組L*值均顯著高于對(duì)照組；由圖6B可知，對(duì)照組和AICAR組a*值在24 h分別達(dá)到最大值22.69、20.28，AICAR組a*值除168 h外，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），成熟后期a*值下降可能是因?yàn)榧∪庵醒鹾霞〖t蛋白（oxymyoglobin，OMb）含量逐漸降低所致，這與陳景宜等[29]指出的不同部位宰后牛肉成熟期間a*值變化趨勢(shì)基本一致；由圖6C可知，兩組b*值在120 h達(dá)到最大值之后顯著下降，其中12～24 h，AICAR組b*值均顯著高于對(duì)照組，這與王瑋等[30]研究的豬背最長(zhǎng)肌b*值于72 h后呈下降趨勢(shì)的結(jié)果不完全一致，這可能與研究的樣本及宰后成熟時(shí)間的不同有關(guān)。

2.7.2 蒸煮損失率的變化

圖7 宰后成熟過(guò)程中蒸煮損失的變化Fig. 7 Changes in cooking loss during postmortem aging

保水性是影響牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，較少的蒸煮損失能一定程度上表征牛肉良好的保水性。由圖7可知，兩組蒸煮損失率均呈先升后降的變化趨勢(shì)，宰后72 h達(dá)到最大值，這是因?yàn)榇藭r(shí)肌肉pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白分子間斥力減少，肌肉內(nèi)部空間變小，保水性降低[31]。24～120 h，AICAR組蒸煮損失率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；168 h時(shí)，兩組蒸煮損失率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.7.3 剪切力的變化

剪切力能夠反映宰后肌肉嫩度，其值越低表示肉的嫩度越好。由圖8可知，兩組剪切力均呈先升后降的變化趨勢(shì)，72 h后牛肉剪切力顯著降低，這可能是因?yàn)樵缀蠹∪膺_(dá)到最大僵直后，肌纖維被肌肉內(nèi)源酶破壞，肌肉嫩度增大所致。

圖8 宰后成熟過(guò)程中剪切力的變化Fig. 8 Changes in shear force during postmortem aging

2.7.4 MFI的變化

圖9 宰后成熟過(guò)程中MFI的變化Fig. 9 Changes in MFI during postmortem aging

由圖9可知，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組MFI均呈逐漸上升的趨勢(shì)（P＜0.05），表明肌原纖維蛋白降解程度越來(lái)越高，肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，肉的嫩度越好。成熟至12 h時(shí)，對(duì)照組與AICAR組MFI分別為31.84、38.73，AICAR組MFI值提高了21.64%，成熟至72 h，對(duì)照組與AICAR組MFI分別為55.67、64.74，AICAR組MFI值提高了14.01%。除0 h外，AICAR組的MFI均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），可見(jiàn)，AICAR能夠加速宰后肌肉成熟速度并提高肌肉嫩度。

2.7.5 肌肉微觀結(jié)構(gòu)變化

圖10 宰后成熟過(guò)程中肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig. 10 Changes in microstructure of myofibrils during postmortem aging

從圖10可看出，宰后成熟期間兩組肌纖維結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化。成熟至24 h，對(duì)照組肌纖維結(jié)構(gòu)完整清晰、連接緊密、排列有序，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，肌纖維結(jié)構(gòu)被破壞，宰后120 h，肌纖維大面積溶解斷裂，出現(xiàn)大量肌原纖維小片；宰后12～120 h，AICAR組肌纖維結(jié)構(gòu)破壞程度大于對(duì)照組，表明AICAR能夠通過(guò)提高AMPK活性，提高肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞程度，進(jìn)而加快宰后肌肉成熟進(jìn)程。

3 結(jié) 論

AICAR能夠提高宰后成熟過(guò)程中肌肉AMPK活性和AMPKα基因及P-AMPK表達(dá)量，顯著加快肌糖原降解、pH值下降和乳酸積累的速率（P＜0.05），加快宰后肌肉糖酵解進(jìn)程，同時(shí)AICAR組L*值、b*值、MFI和蒸煮損失高于對(duì)照組，剪切力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），通過(guò)對(duì)AMPK活性的調(diào)控，得到AMPK調(diào)節(jié)肉質(zhì)的可能機(jī)理是，AMPK活化后改變肌肉糖原含量、乳酸積累量、pH值、肌肉內(nèi)環(huán)境及微觀結(jié)構(gòu)，使糖酵解的程度和速度發(fā)生改變，影響宰后肌肉的成熟進(jìn)程，牛肉較早進(jìn)入僵直完成成熟；因此AMPK及其級(jí)聯(lián)效應(yīng)是改善肉品品質(zhì)的重要靶點(diǎn)，未來(lái)可通過(guò)調(diào)控AMPK活力以改善肉品品質(zhì)。