倪二茹，肖晶晶，吳少鴻，李欣，謝華斌，姜萍萍

(1廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院，福建廈門361004；2廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3深圳美因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室)

馬凡綜合征(MFS)是一種常染色體顯性遺傳性結(jié)締組織疾病[1]，它的發(fā)生與多種基因的突變密切相關(guān)[2]，主要是人原纖維蛋白1基因(FBN1)[3]和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體(TGFBR)基因[4]。其中，以FBN1基因突變與馬凡綜合征相關(guān)性的研究最多[5]。FBN1基因突變的類型多樣，新的突變位點(diǎn)仍不斷被發(fā)現(xiàn)，目前已報(bào)道的FBN1突變超過1 800種[6]。FBN1基因突變的類型和位點(diǎn)與臨床表型有直接的關(guān)系，通過基因測(cè)序的方法分析FBN1基因的突變情況，有助于馬凡綜合征的分子診斷和家系遺傳分析，同時(shí)可以研究FBN1基因突變與臨床表型之間的關(guān)系[7, 8]。2018年11月，我們對(duì)1例臨床確診馬凡綜合征患者的FBN1基因進(jìn)行檢測(cè)和分析，在分子水平上探討該患者致病的可能原因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院收治的1例患有馬凡綜合征的先證者及其所有家系成員。先證者男性，18歲，于12歲時(shí)體檢發(fā)現(xiàn)心臟雜音，無明顯不適，身高體長(zhǎng)且明顯高于同齡人，胸部外凸畸形，CT檢查發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈根部增寬，心臟超聲提示二尖瓣、三尖瓣脫垂并關(guān)閉不全(見圖1)，臨床診斷為馬凡綜合征，未予特殊處理。后患者定期復(fù)查，瓣膜反流逐漸加重。14歲時(shí)先證者心臟超聲檢查示左心室內(nèi)徑(LVD)63 mm，左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)70%，二尖瓣葉脫垂合并重度關(guān)閉不全，三尖瓣葉脫垂合并輕度關(guān)閉不全。后先證者于14歲時(shí)接受全麻下二尖瓣替換手術(shù)，術(shù)中探查見二尖瓣瓣葉增厚，鍵索纖細(xì)延長(zhǎng)，二尖瓣瓣葉脫垂，瓣環(huán)擴(kuò)張，瓣口對(duì)合不嚴(yán)。術(shù)中進(jìn)行了雙葉機(jī)械瓣間斷縫合，完成二尖瓣置換術(shù)。測(cè)試瓣膜啟閉良好。術(shù)后患者恢復(fù)良好，復(fù)查未見異常。本研究符合赫爾辛基宣言，并得到了廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。先證者及其所有家系成員均簽署了知情同意書。先證者及其所有家系成員的個(gè)人信息均得到嚴(yán)格的保密。

1.2 家系情況 該先證者家系成員2代共3人，其中患病者1例(即先證者，男性)，見圖2。先證者的父母無馬凡綜合征的臨床癥狀，先證者無兄弟姐妹，父母雙方無相關(guān)癥狀的親屬。

1.3 基因組DNA提取 經(jīng)先證者及其所有家系成員同意，取先證者及其父母外周靜脈血4 mL，利用全血基因組提取試劑盒(HiPure Tissue & Blood DNA Kit，美基生物)提取基因組DNA，并測(cè)定濃度。

1.4 目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序 采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行基因檢測(cè)。具體步驟如下：采用Agilent定制化探針試劑盒(瑞士Roche公司)建立含目標(biāo)基因的全基因文庫(kù)，包括已知的13種遺傳性心源性猝死相關(guān)疾病的88個(gè)基因，其中包括馬凡綜合征相關(guān)基因(FBN1、TGFBR1和TGFBR2)。采用Illumina HiSeq2500測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行高通量測(cè)序。

注：左上為CT示主動(dòng)脈根部寬度為4.46 cm；右上為心臟彩超示三尖瓣反流；左下為心臟彩超示二尖瓣反流；右下為心臟彩超示二尖瓣脫垂。

圖1 先證者心臟超聲表現(xiàn)

注：Ⅰ:1、Ⅰ:2分別為先證者的父母；Ⅱ:1為先證者。

圖2 先證者的家系圖

1.5 生物信息學(xué)分析 對(duì)上述測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)采用BWA軟件(http://biobwa.sourceforge.net)與hg19人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/)進(jìn)行比對(duì)，之后使用GATK軟件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)進(jìn)行變異分析，變異位點(diǎn)經(jīng)深圳美因臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室自研的軟件進(jìn)行注釋。變異注釋工作包括：識(shí)別單核苷酸變異(SNV)、插入和缺失變異(INDEL)是否引起蛋白質(zhì)編碼或者是氨基酸改變，識(shí)別變異是否在保守區(qū)域；識(shí)別變異在人群數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率，數(shù)據(jù)庫(kù)包括國(guó)際千人基因組計(jì)劃t(http://browser.1000genomes.org/)、美國(guó)國(guó)家心肺和血液研究所外顯子組測(cè)序計(jì)劃(https://evs.gs.washington.edu/EVS/)、外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)(ExAC，http://exac.broadinstitute.org/)和Dbsnp數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)等；計(jì)算突變有害性分?jǐn)?shù)；查找變異與疾病之間的關(guān)系，用到的數(shù)據(jù)庫(kù)包括HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、OMIM(https://omim.org/)、NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和CGD(http://www.candidagenome.org/)。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的純合變異以及最小等位基因頻率(MAF)大于0.01進(jìn)行過濾，進(jìn)一步篩選先證者樣本中的DNA變異。

1.6 位點(diǎn)解讀 數(shù)據(jù)解讀規(guī)則參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(ACMG)相關(guān)指南。

1.7 Sanger測(cè)序 經(jīng)目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序篩選的候選變異位點(diǎn)采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)在先證者父母中進(jìn)一步驗(yàn)證。具體操作步驟如下：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min；將PCR產(chǎn)物送至賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.8 蛋白結(jié)構(gòu)分析 將突變后的DNA序列進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測(cè)，之后使用SWISS-MODEL找到與目標(biāo)序列一致度≥30%的已知結(jié)構(gòu)作為模板。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序 經(jīng)目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序，共產(chǎn)出773.80 Mb數(shù)據(jù)，比對(duì)率達(dá)99.83%，目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度為523.53x，覆蓋度為99.90%。其中FBN1 TGFBR1和TGFBR2基因的測(cè)序深度分別達(dá)542x、516x、593x，覆蓋度均為100%。共檢測(cè)出單核苷酸變異位點(diǎn)(包括錯(cuò)義突變和同義突變)124個(gè)；插入和缺失變異2個(gè)。通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)過濾，頻率小于0.01的罕見突變有3個(gè)。

2.2 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)先證者攜帶FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變。轉(zhuǎn)錄本NM_000138.4，氨基酸變異p.F675Vfs*42，雜合突變，未在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及EXAC數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)突變頻率。該突變位于17號(hào)外顯子區(qū)，屬于移碼突變，導(dǎo)致了675位的苯丙氨酸變成了纈氨酸，并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第675位密碼子下游42位密碼子處，因此會(huì)生成一個(gè)縮短并變異的RNA以及蛋白。

2.3 Sanger測(cè)序 采用Sanger測(cè)序?qū)BN1基因移碼突變的先證者及其父母進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，先證者為FBN1(c.2023_2026delTTTG,p.F675Vfs*42)的雜合移碼突變，與目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序發(fā)現(xiàn)的FBN1基因突變一致，而其父母不具有該突變，因此該突變?yōu)樾律蛔?denovo突變)。見圖3。

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)分析 建立FBN1基因p.F675Vfs*42突變翻譯的異常蛋白3D構(gòu)象后，顯示移碼突變導(dǎo)致了675位的苯丙氨酸變成了纈氨酸，并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第675位密碼子下游42位密碼子處。FBN1編碼的正常的FBN1前體由2871個(gè)氨基酸組成，而p.F675Vfs*42突變編碼的只有716個(gè)氨基酸，缺失了大部分的原FBN1正常結(jié)構(gòu)，徹底改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，損壞了蛋白質(zhì)的功能，不能轉(zhuǎn)化成正常的FBN1。

注：A為患者Sanger測(cè)序結(jié)果，存在c.2023_2026delTTTG突變，雜合缺失；B為患者父親Sanger測(cè)序結(jié)果，無突變；C為患者母親Sanger測(cè)序結(jié)果，無突變。

圖3 先證者及其父母FBN1基因的Sanger測(cè)序峰圖

3 討論

馬凡綜合征是一種常染色體顯性遺傳的疾病，常表現(xiàn)為蜘蛛指(趾)病、細(xì)長(zhǎng)肢體病、長(zhǎng)肢病、指(趾)過長(zhǎng)綜合征、長(zhǎng)瘦、抑郁癥、蜘蛛手合并晶狀體脫位等[1]。在遺傳學(xué)上，馬凡綜合征具有外顯率高、表現(xiàn)度不一等特點(diǎn)，故臨床表現(xiàn)多種多樣[9, 10]，主要變現(xiàn)為骨損壞、眼損害及心血管病變?nèi)?lián)征。該病屬于結(jié)締組織遺傳缺陷疾病，其病變可累及全身各個(gè)系統(tǒng)，而嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥是患者的主要致死因素[11]。根據(jù)修訂版Ghent診斷方案[12]，若患者無馬凡綜合征家族史，但主動(dòng)脈根部直徑Z值≥2，合并晶狀體脫位、FBN1基因突變，系統(tǒng)評(píng)分>7分，三者之一；或晶狀體脫位合并FBN1基因突變并主動(dòng)脈病變，馬凡綜合征診斷成立。本文先證者臨床癥狀表現(xiàn)胸廓畸形、臂展和身高均過大，心臟彩超檢查示主動(dòng)脈根部增寬，二尖瓣、三尖瓣脫垂并關(guān)閉不全，具有典型的馬凡綜合征的臨床表現(xiàn)。

FBN基因家族和TGFBR基因家族是馬凡綜合征的主要致病原因。FBN基因家族中FBN1基因編碼的人FBN1位于15號(hào)染色體的長(zhǎng)臂(15q15～q21.1)，包含65個(gè)外顯子，將近10 000個(gè)核苷酸，編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量約為350 kDa。該蛋白含有47個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域，7個(gè)8-半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，2個(gè)雜交結(jié)構(gòu)域和1個(gè)富脯氨基酸結(jié)構(gòu)域。FBN1蛋白與其他細(xì)胞外基質(zhì)形成彈性纖維，維持組織的彈性。本文在對(duì)先證者的基因組DNA進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序后，分析了馬凡綜合征相關(guān)的FBN1、TGFBR1和TGFBR2基因的突變情況。經(jīng)過生物信息學(xué)技術(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)先證者攜帶了FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變。該突變位于17號(hào)外顯子區(qū)，由于移碼突變，導(dǎo)致了675位的苯丙氨酸變成了纈氨酸，并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第675位密碼子下游42位密碼子處，因此會(huì)生成一個(gè)縮短并變異的RNA以及蛋白。進(jìn)一步的蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)正常FBN1基因編碼的FBN1蛋白有2 871個(gè)氨基酸，而FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變編碼的FBN1蛋白只有716個(gè)氨基酸，缺失了大部分的FBN1蛋白的正常結(jié)構(gòu)，徹底改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，損壞了蛋白質(zhì)的功能，不能轉(zhuǎn)化成正常的FBN1蛋白。根據(jù)ACMG評(píng)估指南，定義該位點(diǎn)為疑似致病突變的變異，而GeneDx基因檢測(cè)公司認(rèn)為該位點(diǎn)為致病突變。Howarth等[13]在2007年首次報(bào)道了該突變，其在兩個(gè)非親屬關(guān)系的馬凡綜合征的患者中檢測(cè)到了該突變；并且在家系驗(yàn)證中，10個(gè)未患病人員未檢測(cè)到該突變，而在5例患病人員中均檢測(cè)到了該突變；且未在各大數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道。除此之外，F(xiàn)BN1基因c.2023_2026delTTTG突變尚未在其他文獻(xiàn)中報(bào)道過。

本文的先證者父母沒有攜帶相同的突變，而先證者沒有兄弟姐妹，故無法對(duì)該基因型與臨床表型的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。雖然沒有該位點(diǎn)與馬凡綜合征的表型關(guān)聯(lián)的文獻(xiàn)研究報(bào)道，但是在與馬凡綜合征相關(guān)的FBN1基因突變中，提早終止密碼突變(PTC)以及移碼突變是FBN1突變中的最主要的兩種類型[14]，PTC突變與嚴(yán)重的骨骼和皮膚表型相關(guān)[15]，很少出現(xiàn)眼部的病變。

綜上所述，本文通過對(duì)1例臨床確診馬凡綜合征的先證者及其父母進(jìn)行FBN1基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)先證者攜帶的FBN1基因c.2023_2026delTTTG突變會(huì)產(chǎn)生一個(gè)截短的FBN1蛋白，可能是馬凡綜合征的一個(gè)致病突變。