陳震，陳恒星，胡開順

0 引言

乳腺癌是全球女性最常見惡性腫瘤之一，近年來占據(jù)女性新發(fā)腫瘤第一位，病死率第四位[1-2]。盡管眾多的診斷手段和治療方式已被陸續(xù)研發(fā)，但尋找更加有效的腫瘤指示因子仍然迫切需要。RCC2于1991年被首次發(fā)現(xiàn)，由于其特殊的細(xì)胞定位，被視為是一種伴隨蛋白[3]。RCC2主要在細(xì)胞G2期和M期表達(dá)，通過結(jié)合并激活A(yù)urora B激酶，促使染色體伴隨復(fù)合體（chromosomal passenger complex, CPC）定位在著絲粒上形成紡錘體，牽引姐妹染色單體的正常分離[4-5]。

近年來，RCC2與腫瘤之間的聯(lián)系被逐漸闡明。研究表明，RCC2在眾多腫瘤中異常表達(dá)，基底細(xì)胞癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]及卵巢癌[9]患者RCC2高表達(dá)，并預(yù)示不良的預(yù)后；微衛(wèi)星穩(wěn)定性結(jié)直腸癌患者RCC2低表達(dá)，預(yù)示著患者差的預(yù)后，而同樣低表達(dá)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腸癌患者卻有著更好的預(yù)后[10]。然而，RCC2與乳腺癌致病發(fā)展之間的關(guān)系仍尚未明確。

本研究首次在乳腺癌MDA-MA-468細(xì)胞系中構(gòu)建了RCC2穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，免疫共沉淀富集RCC2相互作用蛋白后，利用質(zhì)譜鑒定互作蛋白圖譜，生物信息學(xué)分析揭示RCC2在乳腺癌細(xì)胞中的新功能，為進(jìn)一步治療乳腺癌提供依據(jù)并為研究RCC2功能和調(diào)控機(jī)制指明新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達(dá)載體pLVX-DsRed-Monomer-N1購自美國Clontech公司（貨號(hào)：632152）；慢病毒包裝質(zhì)粒載體psPAX2、pMD2.G購自美國Addgene（貨號(hào)：12260；12259）；高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自寶日醫(yī)（北京）生物公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、BamHⅠ、T4 DNA ligase、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和膠純化回收試劑盒均購自美國Thermo公司；兔抗人RCC2單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH購自Santa Cruz公司（TX, USA）。RCC2基因擴(kuò)增上游引物序列為5'-CCGCTCGAGACCATGCCCAGGAAGAA-3'，下游引物序列（含F(xiàn)lag標(biāo)簽）為5'-CGCGGATCCCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCAGAGGGTTCGGGGG-3'。RCC2 qPCR上游引物序列為5'-TTTTCTCAGAGCAGGTCGCC-3', 下游引物序列為5'-TTCGGGGGTTGTATTCTGGC-3'。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞株由中山大學(xué)逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供，用含有10%FBS，100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增RCC2基因 以U2OS全基因組cDNA為模板，高保真酶擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件為：98℃ 3 min；98℃ 10 s；60℃ 5 s；72℃ 100 s；72℃ 10 min（35個(gè)循環(huán)）。取PCR產(chǎn)物電泳檢測。

1.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建 將電泳正確位置PCR產(chǎn)物膠帶割下回收，純化產(chǎn)物經(jīng)過XhoⅠ、BamHI雙酶切，并將其連接到經(jīng)過同樣酶切的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR篩選重組子，并進(jìn)行測序測定，擴(kuò)增測序正確菌落，提取質(zhì)粒為PLVXFlag-RCC2。

1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建 利用慢病毒包裝系統(tǒng)獲得攜帶有表達(dá)載體的病毒感染顆粒，將對(duì)照載體與目的載體病毒分別感染MDA-MB-468細(xì)胞株，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后添加嘌呤霉素，連續(xù)篩選5天獲得穩(wěn)定表達(dá)外源質(zhì)粒細(xì)胞株。Western blot與qPCR驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中目的基因表達(dá)情況。

1.2.5 免疫沉淀與質(zhì)譜鑒定 采用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿擴(kuò)增Flag-RCC2穩(wěn)定過表達(dá)的MDA-MB-468細(xì)胞與陰性對(duì)照細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)定2個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞長滿后，去除上清液，收集細(xì)胞，加入含蛋白抑制劑的RIPA裂解液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,5 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0.5%Nonidet P-40）600 ml，冰上裂解細(xì)胞30 min，每5 min振蕩混勻。4℃ 12 000 g高速離心30 min去除細(xì)胞沉淀，收集上清液。將用裂解液清洗三次的含F(xiàn)lag標(biāo)簽瓊脂糖珠與上清液4℃孵育過夜。次日收集、清洗瓊脂糖珠，獲得互作蛋白。取少量樣品加入蛋白上樣緩沖液，95℃高溫煮10 min，跑10%SDS-PAGE膠后銀染，剩余樣品進(jìn)行置換，除鹽、酶解處理，Orbitrap Tribrid（Thermo）高分辨率質(zhì)譜儀檢測。

1.2.6 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析 采用Protein Discovery（Thermo）軟件搜索數(shù)據(jù)庫，鑒定出蛋白。根據(jù)軟件評(píng)分，選取大于4分的蛋白質(zhì)分子。進(jìn)一步對(duì)高可信度蛋白進(jìn)行聚類分析，包括GO分析，通過生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能三個(gè)層面對(duì)蛋白進(jìn)行聚類；KEGG信號(hào)通路富集分析，預(yù)測該基因參與的調(diào)控通路；蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network, PPIN）的可視化構(gòu)建，獲取蛋白在細(xì)胞中互作的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 兩組間比較用Student t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Flag-RCC2表達(dá)載體與MDA-MB-468穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析思路，見圖1。首先需要構(gòu)建RCC2穩(wěn)定過表達(dá)乳腺癌MDA-MA-468細(xì)胞株。RCC2基因位于染色體1p36位點(diǎn)，編碼區(qū)全長1 569 bp，以U2OS細(xì)胞cDNA為模板，設(shè)計(jì)含F(xiàn)lag標(biāo)簽及酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物，利用高保真酶擴(kuò)增該編碼區(qū)，PCR產(chǎn)物跑膠，結(jié)果顯示獲得與預(yù)期大小一致的片段，見圖2A，切下該位置膠帶回收。同時(shí)對(duì)該產(chǎn)物與表達(dá)載體（結(jié)構(gòu)圖，見圖2B）進(jìn)行雙酶切，兩份酶切產(chǎn)物連接過夜，得到含目的基因的表達(dá)載體。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選菌落測序驗(yàn)證，陽性菌落測序結(jié)果顯示RCC2基因成功插入表達(dá)載體中，序列正確（圖略）。說明表達(dá)質(zhì)粒PLVX-Flag-RCC2構(gòu)建成功。

采用慢病毒包裝感染技術(shù)將外源質(zhì)粒導(dǎo)入MDA-MB-468細(xì)胞中，嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。Western blot和qPCR實(shí)驗(yàn)表明相比對(duì)照組，穩(wěn)轉(zhuǎn)RCC2基因過表達(dá)載體可以實(shí)現(xiàn)MDA-MB-468細(xì)胞內(nèi)RCC2 mRNA及蛋白水平的高表達(dá)，見圖3。

圖1 實(shí)驗(yàn)及分析流程示意圖Figure1 Schematic representation of experimental and analytical workf l ow

圖2 PLVX-Flag-RCC2過表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建Figure2 Construction of PLVX-Flag-RCC2 overexpression vector

圖3 qPCR(A)和Western blot法(B)驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)MDA-MB-468細(xì)胞株中PLVX-Flag-RCC2的表達(dá)Figure3 Expression of PLVX-Flag-RCC2 in stably transfected MDA-MB-468 cell line verif i ed by qPCR(A) and Western blot(B)

2.2 MDA-MB-468穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中RCC2互作蛋白的富集與質(zhì)譜鑒定

收集細(xì)胞，免疫沉淀獲得同RCC2互作蛋白質(zhì)，銀染結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組存在大量與空白對(duì)照組相異的蛋白，見圖4A。質(zhì)譜鑒定出蛋白分子，在同一組實(shí)驗(yàn)中去除實(shí)驗(yàn)組（Flag-RCC2）鑒定得到的陰性結(jié)合的角質(zhì)蛋白，以及對(duì)照組（Flagvector）中出現(xiàn)的假陽性結(jié)合蛋白，再對(duì)兩組重復(fù)中篩選獲得的蛋白取交集，最終得到高可信度的互作蛋白集合共計(jì)164個(gè)，見圖4B。

2.3 RCC2互作蛋白組聚類分析

圖4 RCC2互作蛋白銀染(A)與質(zhì)譜鑒定(B)結(jié)果Figure4 Silver staining of RCC2 interacting proteins(A)and mass spectrometry identif i cation(B)

對(duì)164個(gè)高可信度互作蛋白進(jìn)行GO分析，見圖5A，分子功能分析顯示RCC2及其互作蛋白具有poly（A）RNA結(jié)合能力，并參與翻譯過程中所必須的核糖體組裝過程，值得注意的是，這些蛋白不僅可以結(jié)合RNA，同時(shí)可以結(jié)合核糖體核蛋白，這些信息預(yù)示RCC2可能在乳腺癌細(xì)胞系中介導(dǎo)了蛋白翻譯過程。而GO生物學(xué)過程（BP）分析則提示了這一預(yù)測的正確性，BP分析結(jié)果表明RCC2互作蛋白組主要參與蛋白翻譯，蛋白定位，蛋白折疊等細(xì)胞生理進(jìn)程。細(xì)胞組分分析結(jié)果中胞質(zhì)核糖體大亞基的定位也確定了蛋白翻譯調(diào)控的可能性。對(duì)互作蛋白組進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)RCC2與其相互作用蛋白主要參與核糖體、剪切體、非同源末端連接、病原微生物感染及細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控通路，見圖5B。進(jìn)一步對(duì)互作蛋白組中豐度排名前50的蛋白構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。顏色表示蛋白互作程度，大小表示蛋白富集豐度，我們發(fā)現(xiàn)其中具有重要調(diào)控功能的蛋白分子包括RPL6（60S ribosomal protein L6）、RPL4（60S ribosomal protein L4）、RPS4X（40S ribosomal protein S4, X isoform）、PKM（Pyruvate kinase）、HSPA5（Endoplasmic reticulum chaperone）等，見圖5C。

3 討論

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）和人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）表達(dá)差異，乳腺癌被劃分為不同的分子亞型[11]。其中ER-/PR-/HER2-三陰性乳腺癌具有高度轉(zhuǎn)移侵襲能力以及差的預(yù)后[12]，MDA-MB-468細(xì)胞既屬于這一類型。我們通過在MDA-MB-468細(xì)胞中構(gòu)建RCC2穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，分析RCC2互作蛋白組，探討RCC2基因在乳腺癌細(xì)胞中的功能。與以往研究結(jié)果不同，我們發(fā)現(xiàn)RCC2不僅與細(xì)胞周期相關(guān)[13]，更重要地，RCC2與其互作蛋白富集在核糖體相關(guān)通路中，參與翻譯相關(guān)的胞內(nèi)活動(dòng)，包括Pre-mRNA剪切，結(jié)合核糖體核蛋白，調(diào)控蛋白翻譯及成熟。核糖體是由大小不同兩個(gè)亞基組成，在蛋白作用網(wǎng)絡(luò)中，我們發(fā)現(xiàn)RPL6、RPL4、RPS4X蛋白與RCC2有著密切的互作關(guān)系，其中，RPL6，RPL4是核糖體大亞基組成蛋白[14]，而RPS4X是核糖體小亞基組成蛋白[15]，RCC2同核糖體蛋白的互作揭示其在乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中的翻譯調(diào)控功能。

綜上所述，分析乳腺癌細(xì)胞系中RCC2與其相互作用蛋白組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為揭示RCC2在乳腺癌中的具體功能和作用機(jī)制研究指明方向。RCC2對(duì)蛋白翻譯進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。