王超，楊曉燕，高鳳霞，吳劍，戴天陽

0 引言

我國是食管癌高發(fā)區(qū)[1]，2016年癌癥數(shù)據(jù)分析結果表明，食管癌在我國人群中總發(fā)病率居第3位，總死亡率居第4位[2]。食管癌病死率高且其5年生存率不到30%，預后不佳[3]。隨著免疫治療的進展，免疫因素在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視，但主要集中在基于T細胞的抗腫瘤治療。自然殺傷（natural killer, NK）細胞是人體內非特異性免疫系統(tǒng)的主要組成部分，與T細胞不同，其無需預先致敏即可產生各種細胞因子和趨化因子，對腫瘤和靶細胞起到殺傷作用[4]。而NK細胞的殺傷能力與其表面受體的表達密切相關；其中，活化性受體自然細胞毒受體家族（NKp30、NKp44、NKp46）、NKG2D、與細胞毒作用緊密相關的CD16、與NK細胞成熟相關的抑制性受體NKG2A都是NK細胞表面重要的受體。

多種實體腫瘤的相關研究表明，NK細胞表面受體的表達失衡與腫瘤的發(fā)生機制有關[5]。目前針對NK細胞的研究主要集中在外周血NK細胞的數(shù)量。因此，本研究探討食管鱗癌患者外周血及組織中NK細胞的表型、NK細胞的比例和表面受體表達，以期為探討食管鱗癌免疫逃逸的機制和免疫治療提供基礎研究的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2017年4月—2017年9月間于西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胸心外科確診為食管鱗癌的患者52例；其中男48例、女4例，年齡42～80歲，平均（61.56±8.16）歲。所有患者術前均行胃鏡檢查明確診斷為食管鱗癌，且既往均未接受過手術、化療、放療或其他方式的治療，無慢性感染性病變及其他免疫系統(tǒng)疾病，術后病理組織學再次證實為食管鱗癌，并依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）與美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）聯(lián)合發(fā)布的第8版分期標準行食管癌TNM分期。52例食管鱗癌患者中Ⅰ期17例、Ⅱ期8例、Ⅲ期24例、Ⅳ期3例，35例健康者外周血作為正常對照組。

1.2 標本采集

食管鱗癌患者術前用肝素抗凝管采集外周靜脈血3 ml。同一患者在術中切除病變組織后，根據(jù)組織標本的特征分別取食管鱗癌組織、以距離癌邊緣5 cm以遠的非腫瘤正常食管組織各一塊裝入無菌標本袋中，用4℃冰盒在1 h內送回實驗室。健康者血液標本同樣用肝素抗凝管采集外周靜脈血3 ml。

1.3 試劑和儀器

試劑：熒光標記抗體（FITC-conjugated antihuman CD3，APC-conjugated anti-human CD56，PE-Cy7-conjugated anti-human CD16，PE-conjugated anti-human NKp30，PE-conjugated anti-human NKp44，PE-conjugated anti-human NKp46，PerCPCy5.5-conjugated anti-human NKG2A、PerCP-Cy5.5-conjugated anti-human NKG2D）（所有抗體均購自美國BD公司），人外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋公司），PBS緩沖液（北京索萊寶公司）。

儀器：一次性多功能過濾器、高速離心機、15、50 ml 離心管、流式細胞分析儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）分離 取3 ml淋巴細胞分離液加入15 ml離心管中；用吸管小心吸取健康者或食管鱗癌患者外周靜脈血3 ml，緩慢加于分離液的液面上，650 g離心30 min；離心后，小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一15 ml離心管中，并加入10 ml無菌PBS，重懸細胞；再次4℃、250 g離心10 min，棄上清液后加入5 ml PBS重懸，洗滌2次（4℃、250 g 5 min），得到所需PBMC，用1 ml PBS重懸細胞備用。

1.4.2 組織單細胞懸液獲取 腫瘤組織和正常組織均采用機械網(wǎng)搓法，將具有200目濾網(wǎng)的一次性多功能過濾器放置于15 ml試管上。把剪碎的組織放在網(wǎng)上，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用PBS沖洗，直到將組織搓完，得到腫瘤組織及正常組織單細胞懸液。

1.4.3 組織單個核細胞（Tissue mononuclear cell,TMC）分離 取5 ml淋巴細胞分離液加入15 ml離心管；將得到的單細胞懸液取5 ml緩慢加入淋巴細胞分離液的液面上，650 g 離心30 min；吸取云霧狀中間層后加入10 ml無菌PBS混勻，在4℃恒溫離心機中230 g離心10 min，棄上清液后加入5 ml PBS重懸洗滌1次（4℃、230 g 5 min）再用1 ml PBS重懸得到所需組織中單核細胞。

1.4.4 流式細胞術檢測PBMC及TMC中NK細胞比例和表面受體的表達 取PBMC（或TMC）10 μl加入流式檢測管中，再加入190 μl PBS上機檢測細胞數(shù)；取200 μl PBMC（或TMC）根據(jù)細胞計數(shù)結果，按試劑說明書加入相應劑量的細胞表面分子染色抗體，放入4℃冰箱避光孵育30 min；向每管中加入1 ml PBS進行重懸，室溫、135 g離心5 min；向每孔加入200 μl PBS重懸后，流式細胞儀進行檢測。

1. 5 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計學分析和制圖。采用方差齊性檢驗判斷兩組間方差齊性，當兩者間方差齊時，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異；方差不齊則采用t'檢驗；配對設計采用配對t檢驗；相關性分析采用Spearman相關性分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者外周血和癌組織中NK細胞的分布

食管鱗癌患者外周血中NK細胞比例與健康者之間比較差異無統(tǒng)計學意義（（18.79±1.330）%vs.（16.47±1.100）%, P=0.1812），見圖1A；食管鱗癌組織中NK細胞比例明顯高于正常組織（（4.10±0.370）% vs. （2.48±0.430）% , P=0.0023），見圖1B。

2.2 NK細胞表面受體的檢測

食管鱗癌患者外周血中NK細胞表面活化性受體NKp46、NKG2D的表達明顯低于健康者，NKp44的表達明顯高于健康者，NKp30、CD16的表達無明顯差異；抑制性受體NKG2A的表達明顯低于健康者，見表1、圖2A。

活化性受體NKp30、CD16、NKG2D在食管鱗癌組織的表達明顯低于正常組織；NKp44、NKp46在食管鱗癌組織中的表達明顯高于正常組織。抑制性受體NKG2A在兩者中的表達無明顯差異，見表1、圖2B。

圖1 NK細胞在食管鱗癌患者外周血(A)和組織(B)中的比例Figure1 Ratio of NK cells in peripheral blood(A) and cancer tissues(B) of ESCC patients

2.3 同一食管鱗癌患者外周血和癌組織中NK細胞表面受體分子表達情況分析

同一患者外周血NK細胞和癌組織中浸潤的NK細胞進行配對分析，比較兩者表面受體表達差異。結果提示癌組織中的NK細胞活化性受體NKp44表達量較外周血明顯升高（P＜0.0001），其他活化性受體NKp30、CD16、NKG2D在腫瘤組織中表達量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），NKp46在腫瘤組織中表達量雖有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.1020）；抑制性受體NKG2A表達則明顯升高，見表2、圖3。

2.4 食管鱗癌患者外周血及腫瘤中浸潤的NK細胞比例與腫瘤分期相關性分析

隨著腫瘤進展，食管鱗癌患者外周血中NK細胞逐漸減少（r=-0.276； P=0.0476）； 腫瘤侵襲程度越高癌組織中浸潤的NK細胞越少（r=-0.2842；P=0.0412）。外周血與癌組織中浸潤的NK細胞數(shù)與腫瘤進展成負相關，見圖4。

2.5 食管鱗癌患者外周血及癌組織中NK細胞亞型分析

結果顯示：食管鱗癌組織中NK細胞仍主要為CD56dim亞群細胞，見圖5。提示食管鱗癌組織中浸潤的NK細胞與外周血中的NK細胞可能為同一亞群細胞。

表1 NK細胞表面受體的表達結果Table1 Expression of NK cells surface receptors

3 討論

腫瘤的發(fā)生、轉移與腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視密切相關[6]。NK細胞是天然免疫的重要組成部分，在機體免疫監(jiān)視中起著重要的作用。相關研究結果顯示: 晚期小細胞肺癌患者外周血中NK細胞比例較健康者升高，提示細胞免疫已嚴重受損時，天然免疫可能成為晚期患者有力的補充[7]。汪茜茜[8]、劉啟勝[9]等對食管癌患者外周血中NK細胞比例分析結果顯示，食管癌患者外周血中NK細胞比例高于健康者。本研究結果與之一致，但可能因標本數(shù)量原因未能達到統(tǒng)計學差異。相關文獻表明，NK細胞可通過細胞因子作用被募集到腫瘤微環(huán)境中，參與抗腫瘤作用[10]。由此推測食管鱗癌微環(huán)境可能從外周血中招募NK細胞到達腫瘤組織或可能刺激腫瘤微環(huán)境中NK細胞增殖，有待進一步研究。本研究結果提示食管鱗癌外周血及癌組織中浸潤的NK細胞比例與腫瘤分期呈負相關，國內外學者研究結果發(fā)現(xiàn)外周血和食管癌組織中浸潤的NK細胞比例均與腫瘤分期、良好的預后相關[11-12]。本研究結果與他們的報道相一致。

圖2 食管鱗癌患者外周血(A)和組織(B)中NK細胞表面受體的表達Figure2 Expression of NK cells surface receptors in peripheral blood(A) and tissues(B) of ESCC patients

表2 同一食管鱗癌患者外周血和癌組織NK細胞表面受體的表達Table2 Comparison of NK cells surface receptor expression in peripheral blood and cancer tissues of the same patient

NK細胞的功能取決于其表面受體的表達情況[13]。NKp30、NKp44、NKp46組成了自然細胞毒受體家族（natural cytotoxicity receptors,NCR）是NK細胞表面重要的活化性受體，對NK細胞免疫功能起著重要的作用，其中NKp44僅表達于激活的NK細胞表面[14]；CD16是NK細胞啟動抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）重要的活性受體[15]；NKG2D同樣作為NK細胞表面重要的活化性受體，相關文獻報道腫瘤微環(huán)境中TGF-β對抑制該活性受體的表達有明顯的下調作用[16]。NK細胞主要的抑制性受體NKG2A與NK細胞的成熟相關[17]。本研究結果表明：盡管食管鱗癌患者外周血中NKp44的表達明顯高于健康者，但兩者的表達量均不足1%，因為NKp44僅表達在激活的NK細胞表面，該結果提示食管鱗癌患者外周血中NK細胞可能并未被激活，而與NK細胞啟動抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用相關的、重要的活性受體CD16的表達兩者并無差異，且均為高表達；提示食管鱗癌患者外周血中NK細胞未被激活且仍可能發(fā)揮正常的免疫功能。癌組織中檢測結果表明：NKp44在食管鱗癌組織中的表達明顯高于正常組織、CD16的表達量則明顯低于正常組織；提示食管鱗癌組織中浸潤的NK細胞被激活，但其細胞毒性作用可能減弱。

圖3 同一食管癌患者外周血和癌組織中NK細胞表面受體的表達Figure3 Expression of NK cells surface receptor in peripheral blood and cancer tissues of the same patient

圖4 食管鱗癌患者外周血和癌組織中NK細胞比例與TNM分期的相關性Figure4 Correlation between TNM staging and NK cell ratio in peripheral blood and cancer tissue of ESCC patients

相關研究已經(jīng)證實，人類外周血中NK細胞主要為CD56dim細胞，其CD16高表達，細胞毒活性強，以發(fā)揮殺傷功能為主；組織中NK細胞則主要為CD56bright細胞，其CD16低表達，以分泌細胞因子為主，兩亞群細胞功能上存在差異[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中NK細胞仍主要為CD56dim亞群細胞，提示食管鱗癌組織中浸潤的NK細胞與外周血中的NK細胞可能為同一亞群細胞。外國學者[19]對肺癌患者NK細胞分析同樣發(fā)現(xiàn)，外周血中NK細胞可被招募到腫瘤組織中，但腫瘤細胞可通過調解自身細胞因子的表達來降低被招募而來的NK細胞的細胞毒性。本研究通過對同一患者外周血及癌組織中NK細胞表面受體表達情況配對分析結果提示：當外周血中的NK細胞被招募到食管鱗癌組織中后被激活（NKp44的表達量從外周血中不足1%的表達，變?yōu)?3%）；但其CD16的表達量則被明顯降低（在外周血中的表達為97.9%，在癌組織中則為52.56%），說明NK細胞的ADCC作用被削弱，同時其他活化性受體NKp30、NKp46、NKG2D在腫瘤組織中表達量也被降低，但抑制性受體NKG2A的表達則被增強。相關研究表明隨著NK細胞的成熟，NKG2A在正常CD56dim亞群NK細胞中為低表達[20]，說明癌組織中的NK細胞可能為不成熟的NK細胞或者腫瘤微環(huán)境可能逆轉了NK細胞的成熟。因此推測，食管鱗癌患者外周血中NK細胞具有同健康者相同的免疫功能，當被招募到癌組織中后雖然能被激活，但其可能受到腫瘤微環(huán)境的影響表面受體表達失衡，其細胞毒性功能可能減弱，這可能介導食管鱗癌細胞發(fā)生腫瘤免疫逃逸。

綜上，推測食管鱗癌組織中NK細胞表面受體表達失衡是導致其免疫功能減弱、介導食管鱗癌細胞發(fā)生免疫逃逸的原因之一，為進一步探討食管鱗癌中NK細胞的免疫逃逸機制提供依據(jù)。

圖5 食管鱗癌患者外周血(A)和組織(B)中NK細胞亞群分析Figure5 NK subsets in peripheral blood(A) and tissues(B) of ESCC patients