王守朝，陳興濤，劉 濤 ，宋 淵，謝春華

(1.金昌市中西醫(yī)結合醫(yī)院 ，甘肅 金昌 737100； 2.甘肅省中醫(yī)院， 甘肅 蘭州 730050)

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)主要以膝關節(jié)疼痛、腫脹、關節(jié)積液、功能障礙，以及晚期的關節(jié)變形等為臨床表現(xiàn)[1]。KOA的發(fā)病機制尚不明確，中醫(yī)學認為風寒濕邪阻滯、經(jīng)絡不通、肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)是該病的基本病機[2]；西醫(yī)學認為該病與年齡、性別、遺傳、肥胖、急性損傷和慢性勞損等因素有關，主要以關節(jié)軟骨的退變、軟骨關節(jié)緣骨贅形成為病理基礎，從而引起滑膜、關節(jié)囊和軟組織的損傷和炎癥反應[3]。不管是中醫(yī)學還是發(fā)展迅速的西醫(yī)學，對KOA的治療都有自己獨到的優(yōu)勢。本實驗通過觀察消腫止痛顆粒對改良Hulth法膝骨關節(jié)炎模型大鼠關節(jié)軟骨的形態(tài)學改變、NF-κB mRNA及ICAM-1 mRNA表達情況的影響，以期為消腫止痛顆粒在治療KOA方面的臨床運用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

10月齡SPF級健康Wistar 大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g，生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2015-0035，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。安靜狀態(tài)下適應性飼養(yǎng)1周，飲水、飼料充足，光照周期12L/12D(7：00-19：00)，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±10)%。

1.2 藥品、試劑與儀器

消腫止痛顆粒處方組成：當歸、生地黃、川芎、白芍、桃仁、紅花、三七、青皮、木香、澤蘭、獨活、秦艽。藥液由甘肅省中醫(yī)院制劑科生產(chǎn)，批號20051122。硫酸氨基葡萄糖片，0.314 g/片，新興同仁藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號16030；注射用青霉素鈉，400萬單位/支，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品， 批號S1207502。PrimeScript TM RT reagent Kit逆轉錄試劑盒(批號DRR037)、SYBR? Premix Ex Taq TM實時定量PCR試劑盒(批號RR820A)，均為寶日醫(yī)生物技術有限公司產(chǎn)品； E.Z.N.A. Total RNA KitⅠ，美國Omega公司產(chǎn)口，批號R6834-01；PBS緩沖液，北京藍博斯特生物科技有限公司產(chǎn)品，批號NYJ0985；TRIZOL試劑， Invitrogen 公司產(chǎn)品，批號16105；瓊脂糖，上海川翔生物科技有限公司產(chǎn)品，批號0000101527；EDTA緩沖液，上海西唐生物科技有限公司產(chǎn)品，批號000152532。熱電88400V60型-80 ℃超低溫冰箱，美國 Thermo 公司產(chǎn)品；OLYMPUSCH光學顯微鏡，產(chǎn)地日本；CT14RD型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；S1000型PCR熱循環(huán)儀、熒光定量PCR儀，均為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品 。

1.3 動物分組與模型的建立

將大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型對照組、硫酸氨基葡萄糖片組、消腫止痛顆粒組4組，每組20只。適應性喂養(yǎng)1周。1周后，按照文獻[4]方法造模。采用質(zhì)量分數(shù)為100 g/L 的水合氯醛按3.5 μL/體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，固定于手術臺上，選取左后側膝關節(jié)為手術區(qū)域，常規(guī)備皮，消毒,取髕旁內(nèi)側縱切口(切口長約1.2 cm)。假手術組僅切開皮膚，然后直接縫合。其余各大組采用改良Hulth法造模：用小尖刀片逐層依次切開皮膚、筋膜，打開關節(jié)腔，拿鑷子將髕骨向外側推至脫位，屈曲膝關節(jié)，暴露前交叉、內(nèi)側副韌帶，先切斷前交叉、內(nèi)側副韌帶，再摘除內(nèi)側半月板，保護好周圍其他組織，無菌紗布按壓止血、以生理鹽水沖洗關節(jié)腔并逐層縫合，不包扎。術后每只大鼠給予40萬單位青霉素臀大肌肌內(nèi)注射，連續(xù)7 d。造模后大鼠全部存活，手術傷口未見紅腫、滲出，術后8～10 d基本愈合。傷口愈合后每日驅(qū)趕大鼠活動 0.5 h，驅(qū)趕8周后KOA造模成功。

1.4 給藥方法

按照《中藥藥理研究方法學》[5]中的方法，根據(jù)人和大鼠的計量折算系數(shù)確定給藥量。消腫止痛顆粒組大鼠的劑量約為7 μg/(g·d)，給予消腫止痛顆粒1.87 μL/(g·d)灌胃；硫酸氨基葡萄糖片組給予硫酸氨基葡萄糖片170 μg/(g·d)灌胃；模型對照組給予等體積的質(zhì)量分數(shù)為9 g/L的生理鹽水灌胃；假手術組自由飲水。共灌胃8周。

1.5 檢測指標

灌胃結束，處死大鼠并取樣。

1.5.1 關節(jié)軟骨的肉眼大體形態(tài)觀察

按照文獻[6]方法進行。在光線充足的條件下，逐層切開大鼠左后側膝關節(jié)皮膚、筋膜、關節(jié)囊，充分暴露膝關節(jié)，肉眼觀察關節(jié)軟骨表面破壞程度、光澤及顏色等。

1.5.2 關節(jié)軟骨光鏡觀察

按照文獻[7]方法進行。取右后肢內(nèi)側股骨髁關節(jié)面軟骨，沖洗干凈后放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定，固定2 d，放入質(zhì)量分數(shù) 150 g/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA)脫鈣液中進行脫鈣處理。每周更換1次EDTA脫鈣液。脫鈣4周后，石蠟包埋(包埋時注意控制溫度和切面完整)，切片，HE染色，在100倍光鏡下觀察。按照Mankins標準對HE染色進行評分[8]。

1.5.3 RT-PCR法檢測各組軟骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA的表達

按照文獻[9]方法進行。

總RNA提?。簩㈩A先凍存的軟骨組織從液氮罐中取出，取50 mg軟骨組織，DEPC水沖洗，搗碎置于350 μL的組織裂解液(TRIZOL)內(nèi)，用微量組織勻漿器行勻漿處理，勻漿后加650 μL TRIZOL。裂解完成后加入0.2 mL的氯仿，管蓋蓋緊后顛倒混勻15 s。冰上靜置20 min，會看到氯仿和TRIZOL已經(jīng)分離為上、下兩層，但氯仿層比較混濁，輕輕放入4 ℃ 離心機，離心10 min；離心后，會看到明顯的分層，其中上清液中含有RNA。吸取上清(切勿將中、下層吸進)，按照吸取的上清容積加入異丙醇(異丙醇與上清液的比例為1∶1)，混勻，靜止10 min后再次離心10 min。離心后，底層出現(xiàn)乳白色的固體沉著，倒掉上清液，加體積分數(shù)750 mL /L的酒精(預冷)，吹打，離心2 min。倒掉上清液，加體積分數(shù)750 ml /L的酒精(預冷)，吹打，離心2 min。自然干燥10 min，加入20 μL的DEPC水，吹打，混勻，即得總RNA。

逆轉錄反應：提取總RNA后，采用頸環(huán)結構的MegaPlexTMRNA反轉錄引物混合物進行反轉錄，按照TaKaRa公司逆轉錄說明書PrimeSciptTMRT Waster MIX 操作進行逆轉錄。反轉錄體系如下：PCR反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s,75 ℃延伸30 s，75 ℃終極延伸1 min，共40個循環(huán)。觀察擴增曲線和溶解曲線，溶解曲線以單峰為佳。逆轉錄合成cDNA反應體系見表1。逆轉錄反應設置：在 PCR 儀上，16 ℃，10 min； 37 ℃，30 min；65 ℃，5 min。

表1 逆轉錄合成cDNA反應體系

實時定量熒光PCR：反轉錄結束后按照RT-PCR反應體系進行擴增，以GAPDH作為內(nèi)參對照，進行PCR產(chǎn)物的半定量分析，引物序列見表2。PCR反應體系PCR反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s,75 ℃延伸30 s，75 ℃終極延伸1 min，共40個循環(huán)。觀察擴增曲線和溶解曲線，RT-PCR結果采用相對定量2-ΔΔCt法計算表達量。PCR反應體系見表3。

表2 引物序列

表3 PCR反應體系

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠關節(jié)軟骨的大體形態(tài)觀察

假手術組大鼠的關節(jié)軟骨面光滑、透明，色澤如常，關節(jié)面完整、無裂隙、無潰瘍，關節(jié)表面無明顯變化。模型對照組大鼠的關節(jié)表面粗糙不平，色澤灰暗，軟骨透明度明顯降低，有不同程度軟骨糜爛、潰瘍形成，甚至出現(xiàn)剝脫、缺損、軟骨下骨質(zhì)暴露現(xiàn)象。兩個藥物組大鼠的軟骨透明度、色澤較模型對照組明顯改善，軟骨表面粗糙，整體情況較假手術組略差，個別區(qū)域顏色偏暗。

2.2 各組大鼠關節(jié)軟骨光鏡觀察

假手術組大鼠的關節(jié)軟骨表面光滑，染色清晰，軟骨表層、軟骨移行層、輻射層和鈣化層清楚可辨，細胞排列整齊，層次清晰，染色質(zhì)分布均勻，細胞核清晰。模型對照組大鼠的關節(jié)軟骨表面粗糙，表層變薄甚至消失，部分區(qū)域有絨毛狀表現(xiàn)，裂隙較多可達深層，部分區(qū)域的細胞核固縮、壞死，鈣化層細胞紊亂排列呈簇狀，潮線不完整或消失。兩個藥物組大鼠的軟骨組織損傷程度好于模型對照組,但比假手術組損傷程度嚴重：不規(guī)則排列的軟骨細胞在部分區(qū)域仍可見，但較模型對照組少見，各層界限仍欠清楚，鏡下個別區(qū)域存在簇集現(xiàn)象,基質(zhì)染色較均勻，個別潮線不完整。各組大鼠關節(jié)軟骨HE染色光鏡下病理切片見圖1，Mankins評分對比見表4。

圖1 各組大鼠關節(jié)軟骨光鏡下病理切片(HE，×100)

表4 各組大鼠關節(jié)軟骨Mankins評分對比 分，

注：與假手術組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.3 各組關節(jié)軟骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達對比

與假手術組對比，模型對照組關節(jié)軟骨組織中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達明顯升高(P<0.05)。與模型對照組對比，消腫止痛顆粒組、硫酸氨基葡萄糖片組關節(jié)軟骨組織中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.05)。與硫酸氨基葡萄糖片組對比，消腫止痛顆粒組NF-κB、ICAM-1 mRNA表達差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠關節(jié)軟骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達對比

注：與假手術組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0. 05；與硫酸氨基葡萄糖片組對比，△P<0. 05。

3 討 論

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎是一種慢性、進行性的關節(jié)軟骨退行性疾病。X線片表現(xiàn)為關節(jié)間隙變窄，關節(jié)周圍骨質(zhì)硬化，以及部分或大量骨贅形成。臨床主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛，腫脹，僵硬感，由疼痛引起的活動受限、關節(jié)畸形等。與軟骨相關的軟骨細胞、細胞外基質(zhì)和軟骨下骨三者間合成和分解代謝失衡[10]是KOA發(fā)病的關鍵，力學和生物學因素的共同作用是其發(fā)病的主要根源。正常人軟骨的合成和分解處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但KOA患者關節(jié)軟骨的代謝處于負平衡，即分解大于合成，平衡失調(diào)破壞了患者的關節(jié)軟骨[11]，從而導致關節(jié)軟骨變性、破壞，軟骨下骨發(fā)生硬化，關節(jié)周緣骨質(zhì)增生，滑膜肥厚增生，關節(jié)囊攣縮及肌肉萎縮等[12]。KOA的發(fā)病率隨著年齡的增長而增長，女性較男性多見。來自流行病學的調(diào)查顯示：60歲以上的人群中，約50%的人在X線片上可看到KOA表現(xiàn)，35%～50%有臨床表現(xiàn)；75歲以上的人群中，80%有KOA癥狀[13]。據(jù)有關數(shù)據(jù)顯示：超過50歲的人群中，KOA導致長期殘疾的幾率僅次于排在第一位的心血管疾病。該病有高達53%的致殘率，給社會和家庭造成沉重的經(jīng)濟負擔[14]。因此，探索一種符合我國國情、行之有效的治療方法勢在必行。

NF-κB通路在炎癥因子的表達中起關鍵作用。在未受刺激的情況下，NF-κB二聚體被κBs抑制劑(IκB)隔離在細胞質(zhì)中，通過用IκB的錨蛋白重復結構域掩蓋NF-κB蛋白的核定位信號而將NF-κB蛋白保留在細胞質(zhì)中[14]。激活后，IκB被磷酸化，導致靶向蛋白酶體降解并釋放NF-κB蛋白。隨后，NF-κB蛋白被移入細胞核并開啟其啟動子或其他位點中具有NK-κB結合元件的特定基因的表達[16]。激活IκB激酶(IKKs)以響應幾個信號使IκB蛋白磷酸化并引起它們的降解，這使得游離的NF-κB復合物從細胞質(zhì)轉移到細胞核中并引發(fā)靶基因反式激活[17]。 NF-κB信號通過各種作用廣泛參與骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的病理生理過程，并在衰老和炎癥過程中在OA軟骨細胞中被激活[18]。 NF-κB通路對于誘導各種炎癥相關因子至關重要，包括Mmp蛋白，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，IL-1β和TNF-α，這些誘導的細胞因子進一步激活信號級聯(lián)反應。ICAM-1是介導OA發(fā)病過程中單核細胞粘附和浸潤的重要粘附分子。ICAM-1是一種誘導型表面糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，可介導粘附依賴性細胞間相互作用[19]。 ICAM-1的胞外結構域在白細胞從血管遷移到炎癥部位的過程中起著至關重要的作用。在OA患者的滑膜中已顯示出ICAM-1的上調(diào)，這可能是白細胞募集到滑膜組織中的重要調(diào)節(jié)因子。 此外，通過降低關節(jié)液中ICAM-1的水平能夠抑制OA的炎癥反應和改疼痛癥狀。研究還發(fā)現(xiàn)，ICAM-1基因啟動子上含有NF-κB結合位點[20]。在OA的形成和發(fā)展中，NF-κB還作為關鍵的核轉錄因子調(diào)控ICAM-1的轉錄與表達，使ICAM-1表達增多，吸引單核巨噬細胞、淋巴細胞的侵入和聚集，加重局部的炎癥反應和炎癥損傷。

骨性關節(jié)炎屬中醫(yī)學“骨痹”范疇。骨痹首出于《素問·痹論篇》，指氣血不足或虧虛、風寒濕之邪傷于髓骨而表現(xiàn)出的病癥?！端貑枴らL刺節(jié)論篇》云：“病在骨，骨重不可舉、骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！敝赋龉潜缘闹饕R床癥狀是骨骼酸痛，身體困重，四肢沉重不易舉。骨痹的病位在骨，與五臟關系密切，主要與肝臟、脾臟、腎臟相關，可涉及筋骨、關節(jié)、肌肉。中醫(yī)認為骨痹與“虛”“邪”“瘀”關系密切。腎主骨生髓、肝主筋、脾主肌肉。人到中年后，會逐漸出現(xiàn)肝腎虧虛、骨節(jié)失養(yǎng)，又因膝關節(jié)長期勞損，骨不生髓，髓失骨養(yǎng)，復加瘀阻、風寒濕邪侵襲，遂致經(jīng)絡不暢、氣血不通故而發(fā)病。本虛標實是KOA的主要病機特點。消腫止痛顆粒的主要作用是補腎強筋、活血通絡，由當歸、生地黃、川芎、白芍、桃仁、紅花、三七、青皮、木香、澤蘭、獨活、秦艽組成，可祛風除濕、活血止痛，主要用于治療肝腎虧虛、筋脈瘀滯型的骨痹之病。當歸、川芎活血祛瘀，消腫止痛；桃仁、紅花加強當歸、川芎破瘀血、生新血之力；三七加強行瘀、鎮(zhèn)痛、消腫功效；青皮、木香行氣散結止痛；生地黃、白芍涼血消瘀；澤蘭消散癰腫，減少滲出，促使腫脹消退。諸藥合用，共奏活血化瘀、消腫止痛之效。 綜上所述,消腫止痛顆?？赏ㄟ^降低NF-κB、ICAM-1mRNA含量表達，保護KOA關節(jié)軟骨的病理改變，從而減輕關節(jié)損傷，保護關節(jié)軟骨，延緩KOA病情的進展。