金琳 李海峰 劉衛(wèi)紅 胡侃

中圖分類號 R282.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0344-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.13

摘 要 目的：研究外源性茉莉酸甲酯對滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質（龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷）含量及生理生化指標的影響，為茉莉酸甲酯在滇龍膽規(guī)范化種植中的應用提供科學依據(jù)。方法：分別以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯噴施滇龍膽植株2、4、6、8、10 d（噴施量均為500 mL）后，收集藥材葉為樣品材料，并收集相應時段未噴施處理的藥材葉為對照。采用高效液相色譜（HPLC）法測定4個質量濃度下茉莉酸甲酯噴施10 d后滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量，優(yōu)選茉莉酸甲酯的最佳噴施質量濃度（有效成分含量最高）。采用HPLC法測定以最佳噴施質量濃度茉莉酸甲酯噴施不同時間后滇龍膽葉4種裂環(huán)烯醚萜類物質的含量，并測定其中相關生理生化指標（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和丙二醛）水平。結果：以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯噴施滇龍膽植株10 d后，葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質的含量較未處理葉均不同程度增加，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施后效果最好，此時葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量分別為未處理葉的1.88、2.36和1.87倍（P<0.05）。以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施2、4、6、8、10 d后，葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質的含量均不同程度高于同時段未處理葉；在噴施4 d后葉中龍膽苦苷含量開始出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），在噴施6 d后葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質的含量總體較高，此時葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷含量分別為同時段未處理葉的1.88、1.88、1.47、1.82倍（P<0.05）；并自噴施4 d起，葉中各生理生化指標水平較未處理葉均顯著升高（P<0.05）。結論：以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施6 d后滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量升高最明顯，這可能與其提高了葉中相關生理生化指標的水平有關。

關鍵詞 滇龍膽葉；高效液相色譜法；茉莉酸甲酯；裂環(huán)烯醚萜類物質；含量測定；生理生化指標

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of exogenous methyl jasmonate on the contents of 4 kinds of secoiridoid substance （gentiopicrin， swertiamain， sweroside and amarogentin） and biochemical indexes in the leaves of Gentiana rigescens， and to provide scientific evidence for the application of methyl jasmonate in standardized planting of G. rigescens. METHODS： 2， 4， 6， 8， 10 d after spraying 10， 50， 100， 200 mg/L methyl jasmonate （spraying amount was 500 mL） for G. rigescens strain， the leaves of medicinal material were collected as sample， and the other leaves without spraying methyl jasmonate were collected as control. HPLC method was used to determine the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens after spraying 4 kinds of concentrations of methyl jasmonate for 10 d. The concentration of methyl jasmonate was optimized （the content of effective component was the highest）. HPLC method was adopted to determine the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens after spraying the optimal concentration of methyl jasmonate for different time. The levels of relevant biochemical indexes （SOD， POD， CAT， MDA） were determined. RESULTS： 10 d after spraying 10， 50， 100， 200 mg/L methyl jasmonate for G. rigescens strains， the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves were increased to different extent. Compared with untreated leaves， 100 mg/L methyl jasmonate had the best effect after spraying， and the contents of gentiopicrin， swertiamain and sweroside in treated leaves were 1.88， 2.36 and 1.87 times of those in untreated leaves， respectively （P<0.05）. 2， 4， 6， 8， 10 d after spraying 100 mg/L methyl jasmonate， the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in treated leaves were higher than untreated leaves at corresponding stage； the content of secoiridoid had significant difference after spraying for 4 d （P<0.05）. The contents of active components in general were relatively high after spraying for 6 d， and the contents of gentiopicrin， swertiamain， sweroside and amarogentin in treated leaves were 1.88， 1.88， 1.47， 1.82 times of those in untreated leaves， respectively （P<0.05）. The levels of relevant biochemical indexes in treated leaves were increased significantly since 4 d of spraying， compared with untreated leaves （P<0.05）. CONCLUSIONS： After spraying 100 mg/L methyl jasmonate for 6 d， the contents increase of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens are most obvious， which may be associated with improving the levels of related biochemical indexes.

KEYWORDS Leaves of Gentiana rigescens； HPLC； Methyl jasmonate； Secoiridoid substance； Content determination； Biochemical indexes

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.）又稱堅龍膽、滇龍膽草，為龍膽科龍膽屬多年生宿根草本植物[1]，以根及根莖入藥，具有清熱瀉火、健脾、保肝等作用，主要用于治療黃疸、小兒疳熱、小便不利等癥，是龍膽瀉肝丸、龍膽注射液、小兒清熱片等200多種中成藥的原料藥之一[2-4]。滇龍膽是云南道地藥材，其次生代謝產(chǎn)物裂環(huán)烯醚萜類物質（如龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷等）為主要活性成分[5]，其中龍膽苦苷含量為2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的龍膽藥材的質量控制指標[1]，龍膽苦苷含量的高低直接影響藥材的品質及藥用價值。從生物合成途徑來看，在滇龍膽葉綠體中，牻牛兒基二磷酸酯通過羥基化氧化成檸檬醛，再經(jīng)過環(huán)化、水合和還原形成臭蟻二醛，臭蟻二醛經(jīng)過烯醇化、羥醛縮合和苷化成環(huán)烯醚萜苷，環(huán)烯醚萜苷通過環(huán)斷裂、氧化內酯化最終形成裂環(huán)烯醚萜類物質[6]，故通過調節(jié)代謝途徑提高滇龍膽中主要活性成分的含量具有現(xiàn)實意義。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate）是一種新型植物激素，在植物體內普遍存在，對一些重要的次生代謝過程起到調控作用[7]，目前已應用于多種藥用植物（如三七[8]、茯苓[9]、苦玄參[10]、陽春砂[11]等）中，均能夠誘導提高其相應萜類化合物的含量。因此，本試驗擬以遺傳性狀相同的滇龍膽組織培養(yǎng)苗為研究對象，在人工栽培條件下，通過葉面噴施的方法，探索經(jīng)不同質量濃度茉莉酸甲酯誘導后，滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量及相關生理生化指標[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）]水平的動態(tài)變化，為采用茉莉酸甲酯提高大田栽培滇龍膽中主要活性成分含量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀，包含G1313A ALS自動進樣器、G1315A/B二極管陣列檢測器、ChemStation色譜工作站（美國Agilent公司）；T6新世紀分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；TGL-16C高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；AE240電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK5200H超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；Milli-Q Century系列純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

以同一植株滇龍膽誘導的遺傳性狀相同的組織培養(yǎng)苗為試驗藥材（由大理大學藥物研究所李海峰教授鑒定為龍膽科龍膽屬滇龍膽植株）；龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：分別為ZJ0701BA13、M29J4S1、PN1125- SA13、Z06J6S2，純度：均≥95%）；茉莉酸甲酯（美國Sigma公司，批號：24834483，純度：≥95%）；甲醇（美國Tedia公司，色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 滇龍膽葉樣品的準備與處理

以大理州南澗縣樂秋鄉(xiāng)同一植株滇龍膽的越冬芽為外植株，經(jīng)叢生芽增殖途徑獲得滇龍膽組織培養(yǎng)苗，將組織培養(yǎng)苗栽培3年后，選取狀態(tài)良好、生長一致的滇龍膽植株，分為5個組（4個處理組和1個對照組），每個組間相互間隔5 m，有植株120～140株。在植株開花期分別用10、50、100和200 mg/L的茉莉酸甲酯各500 mL均勻噴灑在不同處理組的滇龍膽植株葉片2、4、6、8、10 d后，收集葉片，作為試驗樣品；并收集相應時段未噴施茉莉酸甲酯的植株（即對照組植株）葉片，作為對照。參照文獻方法[12]，將采集的處理和未處理滇龍膽葉片于50 ℃烘箱中烘干至恒質量，將樣品粉碎，過100目篩，30 ℃烘箱中干燥至恒質量，用封口袋避光保存，備用。

2.2 滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量測定方法的建立

2.2.1 溶液的制備 （1）茉莉酸甲酯溶液。精密稱取茉莉酸甲酯400 mg，用少量無水乙醇溶解后加水制成質量濃度為800 mg/L的母液；再精密吸取母液適量，加水稀釋成質量濃度分別為10、50、100、200 mg/L的茉莉酸甲酯液[7]。（2）混合對照品溶液。精密稱取龍膽苦苷對照品1.9 mg、獐牙菜苦苷對照品1 mg、獐牙菜苷對照品0.5 mg和苦龍膽酯苷對照品0.5 mg，分別置于1、2、10和10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻。分別精密吸取0.4、0.1、0.16和0.16 mL上述4種溶液，置于同一1 mL量瓶中，用甲醇定容，制成龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷質量濃度分別為0.76、0.05、0.008和0.008 mg/mL的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，待用。（3）供試品溶液。精密稱取藥材粉末0.1 g，置于10 mL量瓶中，加入2 mL甲醇，于40 ℃超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理20 min，濾紙過濾；濾渣用 2 mL甲醇按前述步驟重復處理1次，合并2次提取濾液至5 mL量瓶中，冷卻至室溫，加甲醇溶液充分混勻后定容，即得。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，15%→35%A；15～40 min，35%→80%A）；檢測波長：龍膽苦苷為274 nm，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷均為243 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 ?L。取“2.2”項下溶液（供試品溶液為未處理的對照樣品），在此色譜條件下進樣測定。結果，供試品圖譜中的特征峰與雜質峰分離良好（分離度>1.5），理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計不低于3 000。色譜圖見圖1。

2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定滇龍膽根及根莖為藥用部位[2]，而大理州白族民間長期以滇龍膽全草入藥，這可能是因為滇龍膽不同部位主要次生代謝產(chǎn)物存在差異，滇龍膽的主要活性成分裂環(huán)烯醚萜類物質在葉中合成并進行貯藏和分配[6]，且在花期中其葉、花中龍膽苦苷含量最高[14]。故本研究以開花期滇龍膽組培苗為試驗材料，通過葉面噴施茉莉酸甲酯，考察以不同質量濃度處理不同時間后滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量的變化。研究結果表明，茉莉酸甲酯可顯著提高滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量，隨著質量濃度和作用時間的升高或延長，4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量基本上呈先升后降的趨勢，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯處理6 d后的效果最佳。同時還發(fā)現(xiàn)，在本試驗條件下處理10 d后，葉中苦龍膽酯苷含量低于未處理葉，分析原因，這可能是由于茉莉酸甲酯促使植物產(chǎn)生了過多的植保素，對細胞自身的生長產(chǎn)生毒性，不僅抑制了細胞的生長，同時也抑制了代謝物的積累所致[15]。

據(jù)相關研究報道，經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，菜豆[16]、錦繡杜鵑[17]、莧菜芽[18]等植物中相關酶活性增強，次生代謝產(chǎn)物含量增加。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施茉莉酸甲酯4 d后，葉中SOD、POD、CAT活性及MDA的含量較未處理葉均顯著升高（P<0.05），基本上呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且在第4～8天活性增幅明顯，與4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量的變化趨勢基本一致，這可能是由于POD、CAT等酶對外施茉莉酸甲酯產(chǎn)生脅迫的應激反應能在極短的時間內產(chǎn)生響應，通過反饋調節(jié)使植物體內自由基保持正常水平從而提高自身防御性，并迅速調整體內營養(yǎng)物質的運輸和次生代謝的方向[8]。因此，可以認為茉莉酸甲酯處理滇龍膽葉片后，啟動了滇龍膽的防御機制，導致這些防御反應的關鍵酶活性/含量升高，參與了裂環(huán)烯醚萜類物質的生物合成，最終促進了滇龍膽裂環(huán)烯醚萜類物質含量的升高。

綜上所述，通過葉面噴施茉莉酸甲酯，可以顯著提高滇龍膽葉中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯噴施6 d后效果最佳，該方法簡單易行，可以在生產(chǎn)實踐中加以應用，但有關茉莉酸甲酯促進滇龍膽中4種裂環(huán)烯醚萜類物質含量提高及防御酶的表達機制值得進一步深入研究。

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（收稿日期：2018-09-18 修回日期：2018-12-05）

（編輯：林 靜）