楊梅 歐嘉娜

[摘要]目的 建立一種測(cè)定聚多卡醇注射液有關(guān)物質(zhì)和聚多卡醇含量的方法。方法 采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為Nucleosil-120 C18柱（250 mm×4 mm，5 μm）或效能相當(dāng)?shù)纳V柱;流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水=20∶68∶12;流速為1.0 ml/min;柱溫和檢測(cè)器溫度均為45℃;進(jìn)樣量為20 μl。按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定聚多卡醇注射液中的已知雜質(zhì)[正十二醇、C10（EO）nOH、C14（EO）nOH]和未知雜質(zhì)，采用外標(biāo)法測(cè)定聚多卡醇注射液中聚多卡醇的含量。結(jié)果 有關(guān)物質(zhì)中主成分檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為2.7316～109.2638 μg/ml（r=0.99997），相應(yīng)的雜質(zhì)限度范圍為0.05%～2.00%，檢測(cè)限為0.6829 μg/ml。聚多卡醇含量測(cè)定中主成分檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.98～2.93 mg/ml（r=0.99996），平均回收率為99.3%（RSD=0.9%，n=9）。測(cè)定兩個(gè)規(guī)格6批聚多卡醇注射液樣品的含量分別為100.6%、101.3%、102.0%、100.1%、100.8%、101.2%。結(jié)論 本文建立的聚多卡醇注射液中的聚多卡醇含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，簡單可行，可有效控制聚多卡醇注射液的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法;聚多卡醇注射液;有關(guān)物質(zhì);含量

[中圖分類號(hào)] R543? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）8（a）-0015-04

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of related substances and Polidocanol contents in Polidocanol Injection. Methods The method of high performance liquid chromatography-differential refractive index detector method was adopted. The determination was performed on a Nucleosil-120 C18 column （250 mm×4 mm， 5 μm）， or a chromatographic column of comparable potency; the mobile phase consisted of acetonitril-methanol-water was 20∶68∶12; the flow rate was 1.0 ml/min; the temperatures of both the column and the detector were 45℃; the injection volume was 20 μl. The known impurities， such as n-dodecyl alcohol， C10（EO）nOH， C14（EO）nOH）， and unknown impurities in Polidocanol Injection were determined by principal component self-control method without correction factor， and the Polidocanol contents of Polidocanol Injection was determined by external standard method. Results The linear range of main component in related substances test were 2.7316-109.2638 μg/ml （r=0.99997）， and the limits of related impurity were 0.05%-2.0%， the detection limits was 0.6829 μg/ml. The linear range of main component in polidocanol content test were 0.98-2.93 mg/ml （r=0.99996）， the rate of average recovery was 99.3% （RSD=0.9%， n=9）. The contents of 6 batches of Polidocanol Injection samples were determined as 100.6%， 101.3%， 102.0%， 100.1%， 100.8% and 101.2%， respectively. Conclusion The method for determination of Polidocanol contents and related substances in Polidocanol Injection is simple and feasible， which can effectively control the quality of Polidocanol Injection.

[Key words] High performance liquid chromatography method; Polidocanol Injection; Related substances; Content

下肢靜脈曲張是周圍血管疾患中最常見的疾病之一，多見于長期從事持久體力勞動(dòng)或站立工作的人員，已成為各地血管外科門診或病房的首要病種，而且就診人數(shù)呈逐年遞增的趨勢(shì)。針對(duì)此類疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法包括保守壓包扎和彈力繃帶治療、傳統(tǒng)手術(shù)治療和硬化劑注射治療，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率在20%～30%，且恢復(fù)較慢，潰瘍復(fù)發(fā)率極高[1-2]。聚多卡醇注射液是目前公認(rèn)的安全有效的硬化劑，臨床上主要用于下肢靜脈曲張硬化治療[3-7]、近年來逐漸用于靜脈畸形[8-9]、淋巴管畸形[10]、普通嬰幼兒血管瘤[11-12]、盆腔淤血綜合征[13]、化膿性肉芽腫[14]、男性精索靜脈曲張[15]，已于2010年3月31日獲美國批準(zhǔn)用于治療小血管靜脈曲張。聚多卡醇作為血管硬化劑，靜脈內(nèi)注射后，通過化學(xué)作用刺激囊壁，使囊壁上皮細(xì)胞變性、脫水、壞死，并產(chǎn)生無菌性炎癥、纖維組織增生，從而使囊腔粘連、縮小、閉合，逐步吸收并消失[16]。由于中國藥典并未收載聚多卡醇注射液，EP9.0[17]、BP2019[18]和JP17[19]也只有原料藥的標(biāo)準(zhǔn)，因此，為了更好地保證藥品質(zhì)量，本研究通過參考英國藥典原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與本制劑相關(guān)文獻(xiàn)[20-21]，對(duì)現(xiàn)行進(jìn)口藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（JX20150310）[22]進(jìn)行改進(jìn)和完善，結(jié)合聚多卡醇注射液的工藝過程，建立了有關(guān)物質(zhì)的檢查方法，并使用同一色譜條件測(cè)定聚多卡醇的含量，以更好地對(duì)聚多卡醇注射液的質(zhì)量情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器試劑

島津LC-20A型高效液相色譜儀;示差折光檢測(cè)器;LC-solution工作站;乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純;水為純化水。

1.2試藥

聚多卡醇注射液樣品及空白輔料（上海某公司，批號(hào)：7E15110、6K28109、7H23100，規(guī)格：2 ml∶20 mg;批號(hào)：7B13106、6I05107、7H02100，規(guī)格：2 ml∶60 mg）;聚多卡醇對(duì)照品（上海某公司企業(yè)工作對(duì)照品，批號(hào)：PD-16041-R9，含量：98.1%）;正十二醇對(duì)照品（sigma公司，批號(hào)：BCBW5085，含量100.0%）;C10（EO）nOH對(duì)照品（sigma公司產(chǎn)品分裝，批號(hào)：74716，分子式：C26H54O9，CAS：24233-81-6，含量100.0%）;C14（EO）nOH對(duì)照品（sigma公司產(chǎn)品分裝，批號(hào)：74719，分子式：C30H62O9，CAS：27847-86-5，含量100.0%）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Nucleosil-120 C18（250 mm×4 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（20∶68∶12）;流速：1.0 ml/min，柱溫及檢測(cè)器溫度：45℃;進(jìn)樣量：20 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液的制備? 精密量取聚多卡醇注射液樣品適量，加水稀釋制成每1 ml中含5 mg的溶液，作為有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的供試品溶液;精密量取聚多卡醇注射液樣品適量，加水稀釋制成每1 ml中含2 mg的溶液，作為含量測(cè)定的供試品溶液。

2.2.2對(duì)照品溶液及靈敏度溶液的制備? 精密量取供試品溶液適量，用水定量稀釋制成每1 ml中含25 μg的溶液，作為有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的對(duì)照品溶液;取聚多卡醇對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含2 mg的溶液，作為聚多卡醇含量測(cè)定的對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照溶液適量，用水定量稀釋制成每1 ml中含2.5 μg的溶液，作為靈敏度試驗(yàn)溶液。

2.2.3空白輔料溶液的制備? 按“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法，制備不含聚多卡醇的空白輔料溶液。

2.2.4系統(tǒng)適用性溶液的制備? 取聚多卡醇對(duì)照品和正十二醇對(duì)照品適量，加入異丙醇溶解并稀釋，制成每1 ml中含50 mg聚多卡醇和0.75 mg正十二醇的混合溶液，搖勻，量取1 ml，置于10 ml的量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.4”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液20 μl，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。正十二醇峰和聚多卡醇峰的分離度應(yīng)符合要求;聚多卡醇峰的拖尾因子不得超過2.5;理論板數(shù)按聚多卡醇峰計(jì)應(yīng)不低于1000。

有關(guān)物質(zhì)檢查中，靈敏度是重要的檢測(cè)因素。研究結(jié)果提示，柱溫和檢測(cè)器溫度對(duì)檢測(cè)靈敏度有較大的影響。隨著柱溫和檢測(cè)器溫度的升高，正十二醇和聚多卡醇峰的分離度逐漸變小，但主峰（聚多卡醇峰）拖尾因子亦變小，峰形趨于對(duì)稱，靈敏度提高（表1）。綜合各種因素，選擇柱溫和檢測(cè)器溫度均為45℃作為實(shí)驗(yàn)條件。

精密量取系統(tǒng)適用性溶液、空白輔料溶液、供試品溶液（批號(hào)：7B13106）和自身對(duì)照溶液各20 μl進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，聚多卡醇峰與雜質(zhì)峰及雜質(zhì)峰之間分離度均>1.5，空白輔料對(duì)測(cè)定無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4線性關(guān)系及檢出限試驗(yàn)

有關(guān)物質(zhì)采用主成分自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算，對(duì)主成分作線性分析，以濃度（X）為縱坐標(biāo)，峰面積（Y）為橫坐標(biāo)，計(jì)算得到線性方程為Y=0.006 777 74X+0.627 938，r=0.999 97（n=6），主成分在2.7316～109.2638 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限（S/N=3）為0.6829 μg/ml，相應(yīng)的雜質(zhì)限度范圍為0.05%～2.00%。

檢測(cè)聚多卡醇含量的質(zhì)量濃度線性范圍為0.98～2.93 mg/ml，計(jì)算得到線性方程為：Y=167 916.2X-221.5，r=0.999 96（n=5），限度范圍為95.0%～105.0%。

2.5精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下的有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別為3640、3643、3658、3635、3677、3651，計(jì)算RSD值，聚多卡醇峰面積RSD為0.4%，表明該方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的有關(guān)物質(zhì)供試品溶液，分別于1、2、6、8、16、20、24 h時(shí)按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積值，依次為714 444、713 070、712 900、714 807、711 812、714 059、712 441，峰面積RSD=0.2%。各雜質(zhì)及主峰面積均無顯著性變化，RSD均<2.0%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法及限度

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的靈敏度試驗(yàn)溶液20 μl，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件注入高效液相色譜儀，聚多卡醇峰的S/N應(yīng)>10。精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各20 μl，分別按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，正十二醇峰面積≤對(duì)照溶液主峰面積的3倍（1.5%），C10（EO）nOH（相對(duì)保留時(shí)間0.75）和C14（EO）nOH（相對(duì)保留時(shí)間1.5）峰面積分別≤對(duì)照溶液主峰面積的2倍（1.0%），其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積≤對(duì)照溶液主峰面積的0.2倍（0.1%），其他雜質(zhì)峰面積之和≤對(duì)照溶液主峰面積的0.6倍（0.3%）。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

按含量測(cè)定供試品溶液濃度的80%、100%、120%各制備3份聚多卡醇回收試驗(yàn)溶液，測(cè)定溶液中主成分含量，計(jì)算得到平均回收率為99.3%，RSD=0.9%（n=9），回收率良好。

2.9樣品有關(guān)物質(zhì)及聚多卡醇含量測(cè)定結(jié)果

按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件對(duì)兩個(gè)規(guī)格6批聚多卡醇注射液樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，聚多卡醇峰與雜質(zhì)峰及各雜質(zhì)峰之間均得到較好的分離（分離度均>1.5），色譜圖見圖2。

兩個(gè)規(guī)格6批注射液正十二醇均不過1.0%，C10（EO）nOH均不過0.1%，C14（EO）nOH均不過0.2%，其他單個(gè)雜質(zhì)均不過0.1%，其他雜質(zhì)總量均為0.1%（表2）。

按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算聚多卡醇含量。兩個(gè)規(guī)格6批聚多卡醇注射液樣品的聚多卡醇含量分別為100.6%、101.3%、102.0%、100.1%、100.8%、101.2%，均在規(guī)定限度范圍內(nèi)（表2）。

A.混合對(duì)照品;B.供試品溶液（批號(hào)：7B13106）;1.C10（EO）nOH;2.正十二醇;3.聚多卡醇;4.C14（EO）nOH

3討論

3.1檢測(cè)器的選擇

由于聚多卡醇在紫外檢測(cè)器沒有吸收，所以本實(shí)驗(yàn)采用示差折光檢測(cè)器作為本研究的檢測(cè)器，通過控制色譜條件，對(duì)樣品的主成分聚多卡醇和相鄰雜質(zhì)進(jìn)行了有效分離，檢測(cè)器的靈敏度和精密度均符合實(shí)驗(yàn)要求。示差折光檢測(cè)器，其折射率與溫度有關(guān)，因此，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意環(huán)境溫度，以免溫度變化影響保留時(shí)間漂移和測(cè)定結(jié)果。

3.2已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)的選擇

本次實(shí)驗(yàn)得到了企業(yè)的大力支持，企業(yè)提供了聚多卡醇注射液的工藝過程，合成聚多卡醇的起始原料為正十二醇，正十二醇中主要含有正癸醇和正十四醇兩個(gè)雜質(zhì)，在合成過程中，正癸醇和正十四醇和環(huán)氧乙烷生成相應(yīng)的乙氧化脂肪醇，如C10（EO）nOH和C14（EO）nOH，這兩個(gè)有關(guān)物質(zhì)并非聚多卡醇的降解產(chǎn)物，在制劑中的含量保持不變，故正十二醇、C10（EO）nOH和C14（EO）nOH分別作為已知雜質(zhì)進(jìn)行控制，其他雜質(zhì)則為未知雜質(zhì)。

3.3已知雜質(zhì)的相對(duì)校正因子測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用企業(yè)提供的對(duì)照品，對(duì)已知雜質(zhì)進(jìn)行了峰確證，并采用外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算，測(cè)定了3個(gè)已知雜質(zhì)正十二醇、C10（EO）nOH和C14（EO）nOH的響應(yīng)因子。但考慮到今后難以提供這些對(duì)照品，故對(duì)其采用了相對(duì)保留時(shí)間定位，由于3個(gè)已知雜質(zhì)相對(duì)于主成分（聚多卡醇）的校正因子（乘法）分別約為1.2、1.0和1.2，因此采用了不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)量。

本文建立的聚多卡醇注射液中的聚多卡醇含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，簡單可行，可有效控制聚多卡醇注射液的質(zhì)量，值得進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2019-01-07? 本文編輯：孟慶卿）