趙鈺涵　付春　朱琳　馬俊杰　周希萌　李長(zhǎng)生　李愛芹　厲廣輝　夏晗　王興軍　趙傳志

摘要：花青素作為一種抗氧化物質(zhì)，具有多種保健功效。與其他顏色花生相比，黑種皮花生具有良好的感官品質(zhì)，且花青素含量更高。為了揭示花生黑種皮花青素形成和調(diào)控的分子機(jī)理，本研究以黑種皮花生（YH29）和粉紅種皮花生（WH10）為研究對(duì)象，通過RNA-seq技術(shù)比較其轉(zhuǎn)錄組的差異。結(jié)果表明，與粉紅種皮花生相比，黑種皮花生中1 539個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 275個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)花青素生物合成、苯丙素生物合成、類黃酮生物合成等多個(gè)與色素積累相關(guān)的通路在黑色種皮花生中富集。在黑種皮花生中，苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶等5個(gè)與花青素合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因表達(dá)上調(diào)，而與花青素生物合成途徑競(jìng)爭(zhēng)同一底物的一些關(guān)鍵酶基因，如柚皮素和甘草素基因，則表達(dá)下調(diào)，這使得有更多的底物流向花青素合成途徑，這些基因的協(xié)同表達(dá)可能是黑種皮花青素高水平積累的關(guān)鍵。另外，兩個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在黑種皮花生中也表達(dá)上調(diào)，可能是引起花青素合成關(guān)鍵基因表達(dá)差異的關(guān)鍵因素。我們的研究結(jié)果為深入研究花生種皮花青素合成的分子機(jī)理及培育高花青素含量的花生新品種提供了參考。

關(guān)鍵詞：黑花生;轉(zhuǎn)錄組分析;花青素;種皮顏色

中圖分類號(hào)：S565.2：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）09-0001-08

Comparative Transcriptome Analysis Reveals Transcriptional

Regulation in Accumulating Anthocyanins in Peanut Testa

Zhao Yuhan ， Fu Chun3， Zhu Lin ， Ma Junjie2， Zhou Ximeng ， Li Changsheng2，

Li Aiqin2， Li Guanghui2， Xia Han ， Wang Xingjun ， Zhao Chuanzhi

（1. College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;

2. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial

Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China;

3. Weifang Academy of Agricultural Sciences， Weifang 261071， China）

Abstract Anthocyanin is an antioxidant with health benefits to human. In comparison with peanut with other colors， black or dark purple peanut cultivars were enriched in anthocyanin and showed better organoleptic quality. To reveal the molecular mechanism of synthesis and regulation of anthocyanins in peanut， the RNA-seq technology was performed to investigate the transcriptome variation between the black testa （YH29） and pink testa （WH10） cultivars. In comparison with WH10， a total of 1 539 up-regulated and 1 275 down-regulated genes were identified in YH29. Among them， five genes encoding key enzymes of anthocyanin synthesis were up-regulated， while some genes related with competing for the same substrates with anthocyanin synthesis were down-regulated. The different expression of these genes led to more substrates used for anthocyanin synthesis pathway， suggesting that the co-expression of these genes might be the key factor of high anthocyanin accumulation in black testa cultivar. In addition， two R2R3-MYB transcription factors were found up-regulated in YH29， which might play important roles in regulating the differential expression of key genes in anthocyanin synthesis pathway. In conclusion， this study provided a reference for further studying the molecular mechanism of anthocyanin synthesis in peanut and breeding new peanut varieties with high anthocyanin content.

Keywords Black testa peanut; Transcriptome analysis; Anthocyanin; Testa color

花生是一種口感好、營養(yǎng)豐富的油料作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植[1]。我國傳統(tǒng)的花生品種種皮顏色以粉紅色和紅色為主，黑色（或深紫色）種皮顏色的花生品種較少。與常規(guī)花生品種相比，黑色花生含有更多的花青素。

花青素是植物體內(nèi)廣泛存在的一種黃酮類化合物，具有多種生物學(xué)功能?；ㄇ嗨赜欣谥参飩鞣郏N子傳播，同時(shí)在預(yù)防紫外損傷和防止病原體攻擊中具有重要作用[2，3]。在觀賞植物中，花青素、類胡蘿卜素或甜菜色素決定其五彩繽紛的花色[4，5]。對(duì)于很多果實(shí)和花卉來說，花青素是形成其重要品質(zhì)特征的因素之一[6]?；ㄇ嗨啬軌蚯宄?xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的超氧自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。花青素還有預(yù)防癌癥、炎癥和心臟病的功能，如紫色番茄富含花青素，可顯著抑制人結(jié)腸癌和卵巢癌細(xì)胞系的增殖[7，8]。茄科蔬菜中大量花青素可減少血管炎癥和預(yù)防血栓的形成[9]。

花青素的生物合成途徑主要包括以下步驟：①首先，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）作用下生成4-香豆酰-CoA。PAL是苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，決定了花青素合成的關(guān)鍵一步。②4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA在查爾酮合成酶（CHS）催化下合成查爾酮。CHS是花青素代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，催化花青素合成途徑的第一步反應(yīng)，是一類多基因家族編碼的酶[10，11]。目前，已經(jīng)在葡萄[11]等多種植物中克隆鑒定出該類基因，該類基因具有一定的保守性。降低 CHS 基因的表達(dá)水平，會(huì)導(dǎo)致植物花色變淡[12]。③查爾酮異構(gòu)酶（CHI）將查爾酮異構(gòu)化為柚皮素。CHI是最早研究的類黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶。④柚皮素在黃烷酮3-羥化酶（F3H）催化下轉(zhuǎn)化為二氫山奈酚。⑤二氫山奈酚在類黃酮3′-羥化酶（F3′H）和類黃酮3′5′-羥化酶（F3′5′H）催化下分別轉(zhuǎn)化為二氫槲皮素和二氫楊梅素。⑥二氫槲皮素和二氫楊梅素經(jīng)二氫黃酮醇還原酶（DFR）催化分別轉(zhuǎn)化為無色矢車菊素和無色天竺葵素，DFR也可以直接催化二氫山奈酚為無色飛燕草素。⑦無色矢車菊素、無色天竺葵素和無色飛燕草素經(jīng)隱色花青素雙加氧酶（LDOX/ANS）催化，轉(zhuǎn)化為矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素。ANS 基因的表達(dá)直接影響植物花青素的積累，降低ANS的表達(dá)水平，會(huì)導(dǎo)致花青素合成水平明顯下降從而產(chǎn)生白色花[13];而過表達(dá)ANS可以增加花青素的積累[14]。⑧最后，在類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）的作用下形成花青素。在蘋果中CHS、F3H、DFR、LDOX/ANS、UFGT等酶的結(jié)構(gòu)基因協(xié)同表達(dá)決定果皮花青素含量，而葡萄中UFGT表達(dá)在花青素積累過程中起著非常關(guān)鍵的作用[15]。

花青素的合成不僅與CHS、DFR、LDOX/ANS等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)密切相關(guān)，同時(shí)還受轉(zhuǎn)錄因子如R2R3-MYB、bHLH、WD40和HY5的調(diào)控[16]。雖然對(duì)花青素生物合成中的MBW（MYB-bHLH-WD40）絡(luò)合物已有豐富的認(rèn)識(shí)，但MYB轉(zhuǎn)錄因子仍是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，而bHLH轉(zhuǎn)錄因子可單獨(dú)或通過與MYB結(jié)合成為二聚體來結(jié)合DNA[17]，從而啟動(dòng)基因的表達(dá)[18]。紫娟茶紫色葉片MYB-bHLH-WDR復(fù)合物通過激活F3H、DFR和ANS基因表達(dá)來調(diào)控花青素的積累[19]。柿子中WD40蛋白與Myb2和Myb4相互作用共同調(diào)節(jié)原花色素的合成[20]。玉米中MYB蛋白的激活可分為bHLH非依賴性和bHLH依賴性兩種模式，如調(diào)節(jié)玉米中花青素途徑的R2R3-MYB C1蛋白通過與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用以結(jié)合到啟動(dòng)子上，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄;而調(diào)節(jié)玉米中吡咯烷途徑的R2R3-MYB蛋白可以在沒有bHLH轉(zhuǎn)錄因子的情況下激活相同的啟動(dòng)子[21]。有些MYB轉(zhuǎn)錄因子不需要依賴WD40蛋白而參與調(diào)控花青素的合成，如擬南芥MYB11、MYB12和MYB111[22]。這些結(jié)果表明，一部分MYB需要同時(shí)表達(dá)bHLH和WD40才能發(fā)揮作用，而其他MYB可以單獨(dú)誘導(dǎo)花青素合成[23]。HY5是多種光感受器家族的下游因子，促進(jìn)光形態(tài)發(fā)生[24]，其在花青素合成中也可直接與相關(guān)酶基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[25];還可通過誘導(dǎo)擬南芥MYB75/PAP1轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控花青素的生物合成[26]。

隨著研究的深入，擬南芥、葡萄、蘋果等植物中花青素合成和調(diào)控的機(jī)理逐漸清晰，為研究其他植物花青素的合成和調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。本研究利用RNA-Seq分析方法，研究了WH10（粉紅種皮）和YH29（黑種皮）兩種種皮顏色差異較大的花生品種的差異表達(dá)基因，并對(duì)不同種皮顏色品種的花青素生物合成和調(diào)控基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。該項(xiàng)工作有助于加深我們對(duì)黑花生種皮中花青素在代謝和分子水平上的特異性積累的理解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用花生材料分別為黑種皮花生YH29和粉紅種皮花生WH10。YH29由開封市農(nóng)林科學(xué)院鄧麗老師提供;WH10是出口型大花生品種，由濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院付春老師提供。

1.2 花青素含量的測(cè)定

參照Serrano等[27]的方法進(jìn)行花生花青素含量的測(cè)定，具體步驟如下：稱取50 mg 花生葉和莖分別置于1.5 mL 離心管中，在液氮中將其研成粉末;加入700 μL酸性甲醇（甲醇與HCl體積比為99∶1），于4℃過夜提取;然后于4℃、12 000 r/min離心1 min，取600 μL上清液置于新的離心管中，加入1 mL三氯甲烷，再加400 μL蒸餾水，于4℃、12 000 r/min離心10 min，上清液用于花青素含量測(cè)定;利用分光光度儀（U-3000，HITACHI）分別在530 nm與657 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算公式如下：花青素含量=（OD530-0.25OD657）/m，式中，OD530為花青素在530 nm波長(zhǎng)下的光密度，OD657為葉綠素在657 nm波長(zhǎng)下的光密度，m為樣品質(zhì)量（g）。設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，每組重復(fù)測(cè)量3次。

1.3 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建和高通量測(cè)序

采用RNAiso試劑（Takara，中國）從不同花生材料新鮮葉片中分離總RNA，經(jīng)DNase I （Takara，中國）處理，去除污染的基因組DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠和NanoDrop電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。mRNA被富集并分裂成短片段（約200 nt ）。以mRNA片段為模板，利用隨機(jī)六聚體引物合成第一鏈cDNA。第一鏈cDNA與DNA聚合酶Ⅰ、緩沖液、dNTPs、RNase H進(jìn)一步合成第二鏈cDNA。在每一個(gè)片段之后加入一個(gè)核苷酸（腺嘌呤），完成末端修復(fù)，然后將測(cè)序接頭連接到片段上。最后，通過PCR擴(kuò)增純化片段并進(jìn)行富集，構(gòu)建cDNA文庫。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

構(gòu)建好的轉(zhuǎn)錄組文庫由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序使用BGISEQ-500平臺(tái)。測(cè)序所得的raw reads需進(jìn)行質(zhì)控（QC）處理，獲得clean reads用于后續(xù)分析。

1.4 生物信息學(xué)分析

從Peanutbase（https：//peanutbase.org/）下載栽培花生Tifrunner的基因組序列。將clean reads比對(duì)到花生參考基因組上，通過統(tǒng)計(jì)比對(duì)率、reads在參考序列上的分布情況等，判斷比對(duì)結(jié)果是否通過第二次質(zhì)控（QC）。然后進(jìn)行基因定量分析、基于基因表達(dá)水平的各項(xiàng)分析，對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析、pathway顯著性富集分析、聚類、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子等分析。

基因的表達(dá)量采用FPKM（Fragments Per Kilobase Million）進(jìn)行均一化處理，使用Log2（YH29/WH10）計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。差異倍數(shù)為兩倍以上并且Q-value≤0.001的基因?yàn)楸磉_(dá)顯著差異基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生色素積累的表型鑒定

為了研究黑色花生種皮中色素的積累特性，本研究選取了具有典型種皮顏色的代表性品種YH29和WH10。YH29種皮呈黑色，葉、花顏色與WH10相比較深，特別是葉柄，但兩個(gè)品種胚的顏色沒有差異（圖1）。同時(shí)，對(duì)葉和莖中花青素含量進(jìn)行測(cè)定，YH29葉和莖中花青素含量都顯著高于WH10（圖2）。

2.2 高通量測(cè)序和基因表達(dá)譜

為了獲得不同種皮顏色基因表達(dá)譜，利用YH29和WH10構(gòu)建了6個(gè)cDNA文庫，利用BGISEQ-500平臺(tái)對(duì)cDNA文庫進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣品平均產(chǎn)出21.69 Mb數(shù)據(jù)，消除低質(zhì)量序列后共獲得130.11 Mb的clean reads（干凈讀數(shù)），平均讀取率為99.36%（表1）。使用HISAT將clean reads比對(duì)到參考基因組序列，YH29平均有96.14%匹配到參考基因組，WH10平均有95.84%匹配到參考基因組。大部分的轉(zhuǎn)錄本被完整覆蓋，reads均勻分布在轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域。

2.3 差異表達(dá)基因的鑒定和功能分析

使用Bowtie2將clean reads比對(duì)到參考基因組序列上，然后使用RSEM計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平，在兩個(gè)樣品中鑒定出2 814個(gè)差異基因，與WH10相比，YH29中1 539個(gè)表達(dá)上調(diào)，1 275個(gè)表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異基因進(jìn)行GO分類（圖3），分類在生物過程、細(xì)胞成分和分子功能三個(gè)部分中。在生物過程中，“代謝過程”中差異基因的數(shù)目最多，“細(xì)胞過程”差異基因數(shù)目次之，其次是“生物調(diào)節(jié)”、“定位”和“刺激反應(yīng)”。在細(xì)胞成分中，“細(xì)胞”、“膜”、“細(xì)胞器”中差異基因數(shù)目較多。在分子功能中，“催化活性”和“結(jié)合”的差異基因數(shù)目明顯多于其他功能，其中含有多個(gè)MYB、bHLH、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子（表2）。

為了獲得更多的生物學(xué)信息，深入了解花生花青素積累機(jī)制，我們對(duì)KEGG富集途徑進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）表明，有20條途徑被富集，其中，花青素生物合成途徑排在首位。表4列出了與花青素合成通路相關(guān)的基因及其表達(dá)量，14個(gè)相關(guān)基因中有12個(gè)在YH29中表達(dá)上調(diào)，2個(gè)表達(dá)下調(diào)。另外，類黃酮生物合成、異黃酮生物合成等途徑均被富集，以往的研究表明，這些途徑的代謝變化都與花青素的積累相關(guān)。

3 討論

3.1 花青素生物合成關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控

植物中花青素生物合成途徑已經(jīng)相對(duì)比較清楚，在本研究中花青素合成過程中的關(guān)鍵酶PAL、CHS、DFR、LDOX/ANS、UFGT基因表達(dá)均上調(diào)（圖4）。其中，PAL作為苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，其兩個(gè)編碼基因（5H4H17、FI9C9D）表達(dá)上調(diào)，使4-香豆酰-CoA大量積累，為花青素的積累提供更多底物。CHS作為花青素代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，其7個(gè)編碼基因（GQLW6A、95I963、QZN0LQ、BCQ67I、0FI6RG、UDJX6I、BDJ8VI）表達(dá)上調(diào)十分明顯，會(huì)產(chǎn)生大量的查爾酮。2個(gè)DFR基因（7JZ58T、X8EVF3）表達(dá)上調(diào)，可以使更多的二氫山奈酚流入花青素合成途徑，從而產(chǎn)生更多的無色花色素。LDOX/ANS是花青素合成的最后一個(gè)關(guān)鍵酶，在本研究中，編碼LDOX/ANS的7個(gè)基因（UQ0Z3E、AQ6B1J、FYP25E、9KNF1J、KX8RC4、36PEC4、N5X18U）表達(dá)均上調(diào)，直接影響花青素的積累[28]。UFGT是花青素生物合成途徑中的最后一種酶，本研究中，編碼UFGT的一個(gè)基因（31BJ59）也是表達(dá)上調(diào)的。上述結(jié)果表明，PAL、CHS、DFR、LDOX/ANS、UFGT酶的結(jié)構(gòu)基因協(xié)同表達(dá)共同促進(jìn)了花青素積累。

3.2 花青素合成積累過程中支鏈途徑的調(diào)控

花青素生物合成途徑的中間體也可用于合成其他次生物質(zhì)，例如，4-香豆酰-CoA是木質(zhì)素、生物堿的主要前體[30]，三個(gè)合成途徑共同競(jìng)爭(zhēng)底物4-香豆酰-CoA。在木質(zhì)素和生物堿合成過程中，4-香豆酸-CoA連接酶（4CL）長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是該途徑中的一個(gè)重要調(diào)控點(diǎn)[31]。本研究（表5）發(fā)現(xiàn)，黑花生中編碼4CL的基因顯著下調(diào)，使木質(zhì)素合成途徑的中間體減少;同時(shí)編碼咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）的基因也顯著下調(diào)，編碼F5H的基因也是下調(diào)的，COMT和F5H在木質(zhì)素合成的多個(gè)過程中起催化作用，編碼這兩個(gè)酶的基因下調(diào)使木質(zhì)素積累減少，更多的底物進(jìn)入花青素途徑。綜上所述，在木質(zhì)素合成過程中，編碼相關(guān)酶的基因都顯著下調(diào)，其結(jié)果是使更多的底物流向花青素合成途徑。

異黃酮是豆科植物次生代謝產(chǎn)物[32]，異黃酮生物合成途徑與花青素生物合成途徑共同競(jìng)爭(zhēng)底物柚皮素和甘草素。本研究結(jié)果表明，黑花生編碼此過程相關(guān)酶的基因也存在下調(diào)現(xiàn)象，其結(jié)果也使更多的底物流向花青素合成途徑從而增加花青素的積累。

3.3 花青素合成積累過程中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控

花青素代謝途徑受MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，在本研究中，差異表達(dá)基因中有MYB轉(zhuǎn)錄因子31個(gè)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子30個(gè)（表2），表達(dá)量在黑皮花生中上調(diào)最明顯的兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子是與花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB，其中一個(gè)MYB3R-3轉(zhuǎn)錄因子。早期研究發(fā)現(xiàn)它決定器官大小，參與細(xì)胞增殖的時(shí)間和空間調(diào)控，是產(chǎn)生具有特定大小和形態(tài)器官的關(guān)鍵因子[33]。表達(dá)下調(diào)最明顯的一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子是MYB124，研究發(fā)現(xiàn)它在擬南芥中有控制葉片上氣孔數(shù)量的功能[34]。在黑花生中表達(dá)上調(diào)最明顯的bHLH轉(zhuǎn)錄因子屬于bHLH96。一個(gè)HY5蛋白在黑花生中也是表達(dá)上調(diào)的，這些轉(zhuǎn)錄因子可能也參與黑花生中花青素的積累。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)花生品種YH29和WH10種皮、葉、花、莖花青素含量不同，并造成了其顏色的差異。通過比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，YH29花青素生物合成途徑中5種關(guān)鍵酶的編碼基因均上調(diào)表達(dá)，而在與花青素生物合成相競(jìng)爭(zhēng)的其他代謝途徑中編碼相關(guān)酶的基因表達(dá)下調(diào)，其結(jié)果使更多的底物流向花青素代謝途徑。另外， MYB等轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)也可能是調(diào)控YH29中花青素積累的重要因素。本研究結(jié)果可為深入研究花生種皮花青素合成的分子機(jī)理及培育高花青素含量的花生新品種提供參考。

參 考 文 獻(xiàn)：

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收稿日期：2019-09-05

基金項(xiàng)目：山東省良種工程課題（2016LZGC025， 2017LZN032）;山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019GNC106026， 2019GSF107008， 2018GSF121032）;山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2017MC005）;山東省泰山學(xué)者項(xiàng)目;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2018E13， CXGC2016B02）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：趙鈺涵（1992—），女，碩士研究生，主要從事花生基因組學(xué)和遺傳育種研究。E-mail：zyh685119@163.com

通訊作者：王興軍（1966—），男，博士，研究員，主要從事花生基因組學(xué)和遺傳育種研究。E-mail：xingjunw@htomail.com

趙傳志（1981—），男，博士，副研究員，主要從事花生基因組學(xué)和遺傳育種研究。E-mail：chuanzhiz@126.com