榮彩麗，桑春輝，陳東，唐琪

（1.寧波市鄞州第二醫(yī)院 口腔科，浙江 寧波 315000；2.寧波市海曙區(qū)口腔醫(yī)院 牙體牙髓科，浙江 寧波 315000；3.寧波市鄞州第二醫(yī)院 病理科，浙江 寧波 315000；4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310009）

各類(lèi)原因?qū)е碌难懒腥睋p是口腔修復(fù)科患者最常見(jiàn)的疾病類(lèi)型之一，對(duì)患者口腔的美觀和功能具有極大影響[1]。種植牙是將與人體骨質(zhì)兼容性高的材料以外科手術(shù)的方式植入缺牙區(qū)的牙槽骨內(nèi)從而使上部修復(fù)體固位穩(wěn)定的一種修復(fù)方式，已成為口腔醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的缺牙的首選修復(fù)方式[2]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)疏松癥中骨質(zhì)和骨量明顯下降的情況下，種植牙的成功率明顯受限[3]。骨質(zhì)疏松癥是一種以單位體積內(nèi)骨量減少為主要特征的代謝性骨疾病[4]。我國(guó)低骨量人群龐大，是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的高危人群，且其發(fā)病率隨著年齡的增高而顯著上升[5]。然而，迄今為止，骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制仍未能完全揭曉，如何有效地預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松，避免牙種植術(shù)的失敗仍是目前重要的研究方向。

成骨細(xì)胞的活性和分化功能在骨骼發(fā)育和維持中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥患者機(jī)體氧化應(yīng)激水平明顯增高[6]，成骨細(xì)胞的活性和功能受到抑制[7]。因此，擁有抗氧化活性的生物活性劑有望成為治療骨質(zhì)疏松癥的新型藥物。

丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是從丹參中提取出的主要活性成分。作為傳統(tǒng)中藥，丹參一直被廣泛應(yīng)用于功能性食品、制藥、化妝品和營(yíng)養(yǎng)品等行業(yè)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參的藥用功效與其主要活性成分Sal B具有的顯著的抗氧化作用密不可分[9-10]。Sal B可通過(guò)抗氧化功效對(duì)抗過(guò)氧化氫、高糖、低氧等有害刺激引起的氧化損傷[11-13]。然而，Sal B所具有的抗氧化特性對(duì)成骨細(xì)胞的氧化損傷是否能產(chǎn)生保護(hù)作用目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，本研究構(gòu)建成骨細(xì)胞氧化損傷模型，從細(xì)胞活性，胞內(nèi)活性氧水平和分化礦化功能等方面檢測(cè)Sal B的保護(hù)作用，為今后Sal B在骨質(zhì)疏松癥中的防治應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 MC3T3-E1小鼠前成骨細(xì)胞系購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。α-MEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，Sal B（純度≥95%）、叔丁基過(guò)氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、抗壞血酸、β-甘油磷酸、茜素紅S、MTT、多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）熒光染料、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料購(gòu)于美國(guó)Life公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于日本Takara公司，引物、Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：普通培養(yǎng)時(shí)將MC3T3-E1細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每周更換2次。誘導(dǎo)成骨分化時(shí)，在細(xì)胞匯合后，在培養(yǎng)基中加入5 mmol/L β-甘油磷酸鹽和100 mg/mL抗壞血酸配成礦化誘導(dǎo)液，礦化誘導(dǎo)液每3 d更換1次。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定：將MC3T3-E1細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，進(jìn)行不同處理后，通過(guò)MTT法在不同時(shí)間段進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。具體操作方法：細(xì)胞處理完畢后將96 孔板中液體吸盡用0.01 mol/L PBS洗滌2次，然后加入100 μL含有l(wèi).5 mg/mL濃度MTT溶液的α-MEM在37 ℃下孵育4 h。 小心地吸去上部液體，加入100 μL DMSO溶解底部的晶體。將板振蕩15 s徹底混勻后，用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度值。

1.2.3 ROS測(cè)定：將MC3T3-E1細(xì)胞以3×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在放置有爬片的48孔板中。使用DCFH-DA熒光染料檢測(cè)細(xì)胞總ROS水平。每孔加入 10 μmol/L濃度的DCFH-DA在37 ℃下孵育30 min。用PBS清洗3次，以除去多余染料。將細(xì)胞在室溫下在4% PFA中固定30 min。用PBS再次洗滌3次后，將固定的細(xì)胞在室溫下用20 μg/mL的DAPI染色15 min，然后用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞成像，并使用NIH Image J軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.2.4 qPCR：將MC3T3-E1細(xì)胞以6×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中。采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞樣本的總RNA，通過(guò)OD280/OD260比值來(lái)測(cè)定其純度，比值在1.8～2.0為合格。使用帶有g(shù)DNA Eraser的PrimeScript RT試劑盒，用1 mg RNA進(jìn)行cDNA合成。使用表1中列出的基因特異性引物擴(kuò)增cDNA。按照TB Green Premix Ex Taq試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，包括：94 ℃（變性），60 ℃（退火）和72 ℃（延伸）各1 min。每個(gè)cDNA樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)反應(yīng)的循環(huán)熒光信號(hào)，獲得循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）。然后根據(jù)目的基因和管家基因的Ct值，通過(guò)相對(duì)定量方法2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)試3 次，取平均值。

1.2.5 礦化實(shí)驗(yàn)：將MC3T3-E1細(xì)胞以3×104個(gè)細(xì) 胞/孔接種在48孔板中，并用成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化14 d。在成骨分化后，將細(xì)胞用PBS輕輕洗滌2次，并在4 ℃下用4% PFA固定30 min。用去離子水清洗2遍后，將細(xì)胞用0.1%茜素紅染液在室溫下染色1 h。然后用去離子水洗滌細(xì)胞以除去過(guò)量的染料，并在體視顯微鏡下拍攝染色的照片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，2組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 TBHP對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的抑制呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性 與對(duì)照組（不添加TBHP）相比，濃度為125、250、500 μmol/L的TBHP在1 h內(nèi)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著濃度和時(shí)間的增加細(xì)胞活性呈下降趨勢(shì)，250 μmol/L TBHP作用3 h細(xì)胞活性降低為66.4%（P＜0.01），當(dāng)作用6 h后，活性下降為49.6%（P＜0.001），達(dá)到半數(shù)抑制，見(jiàn)圖1。因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用250 μmol/L濃度及6 h作用時(shí)間的處理?xiàng)l件作為MC3T3-E1細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建條件。

圖1 不同濃度TBHP對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

2.2 Sal B恢復(fù)TBHP引起的MC3T3-E1細(xì)胞活性的下降 為了確定Sal B的安全應(yīng)用濃度范圍，本研究首先檢測(cè)了不同濃度的Sal B應(yīng)用48 h對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示1、10、25、50、 100 μmol/L的Sal B處理48 h不影響細(xì)胞活性（P＞ 0.05），當(dāng)濃度達(dá)到125 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性下降 （P＜0.05），見(jiàn)圖2。將1～100 μmol/L不同濃度梯度的Sal B以不同的預(yù)處理時(shí)間處理MC3T3-E1細(xì)胞后用250 μmol/L TBHP處理6 h，細(xì)胞活性結(jié)果提示50 μmol/L預(yù)處理24 h組顯示了最高的恢復(fù)效果 （P＜0.01），與100 μmol/L的效果一致（P＞0.05）。因此本研究選用50 μmol/L濃度預(yù)培養(yǎng)24 h作為后續(xù)檢測(cè)的Sal B處理?xiàng)l件。見(jiàn)圖3。

圖2 不同濃度Sal B對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

2.3 Sal B抑制TBHP引起的MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS的升高 為了檢測(cè)Sal B的抗氧化作用，本研究通過(guò)DCFH-DA熒光染色，將不同組別的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平通過(guò)熒光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示250 μmol/L TBHP作用6 h導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，而50 μmol/L Sal B預(yù)處理24 h后明顯抑制了ROS水平的升高（P＜0.001），見(jiàn)圖4。

2.4 Sal B恢復(fù)MC3T3-E1細(xì)胞的分化和礦化功能 為了檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞的分化礦化功能，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。3 d后檢測(cè)成骨分化相關(guān)關(guān)鍵基因：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），I型膠原（collagen I，COLI），骨鈣素（osteocalcin，OCN）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的表達(dá)水平，結(jié)果顯示TBHP顯著抑制了該類(lèi)基因的表達(dá)，而Sal B的應(yīng)用明顯恢復(fù)了MC3T3-E1細(xì)胞的分化功能（P ＜0.01），見(jiàn)圖5。成骨分化誘導(dǎo)14 d后，通過(guò)茜素紅染色對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中形成的鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行顯色分析的結(jié)果與基因檢測(cè)一致（P ＜0.01），見(jiàn)圖6。

3 討論

圖3 Sal B恢復(fù)TBHP引起的細(xì)胞活性下降

圖4 Sal B抑制TBHP引起的ROS升高（刻度尺為100 μm）

圖5 Sal B恢復(fù)MC3T3-E1細(xì)胞分化功能

鑒于骨質(zhì)疏松對(duì)牙種植修復(fù)成功率的重要影響，本研究從骨質(zhì)疏松癥的病因出發(fā)，通過(guò)檢測(cè) Sal B對(duì)成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，探尋新型治療途徑，為臨床上骨質(zhì)疏松癥患者種植體骨整合水平的改善和提高奠定基礎(chǔ)。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞功能障礙在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病和疾病進(jìn)展過(guò)程中起重要作用[14-15]。過(guò)量產(chǎn)生的活性氧類(lèi)如H2O2、和-OH，是氧化損傷發(fā)生的一大重要誘因[16]。TBHP是有機(jī)過(guò)氧化物的一個(gè)重要分支，是一種最常用的自由基反應(yīng)的引發(fā)劑，其熱穩(wěn)定性好，具有使用安全，易于控制等優(yōu)點(diǎn)，目前已被認(rèn)為是廣泛接受的細(xì)胞氧化損傷模型的引發(fā)劑[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)TBHP可以導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，細(xì)胞活力降低。同時(shí)TBHP也導(dǎo)致了成骨細(xì)胞分化和礦化功能的下調(diào)。

Sal B作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的主要活性成分，可以清除自由基發(fā)揮良好的抗氧化功能，已被用于對(duì)抗眾多系統(tǒng)性疾病的實(shí)驗(yàn)研究，如糖尿病性心臟病[12]、癲癇[20]、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[21]等。本研究結(jié)果表明，Sal B的應(yīng)用顯著減弱了TBHP對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的氧化損傷。DCFH-DA染色顯示Sal B可顯著抑制TBHP誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS。同時(shí)，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示其顯著恢復(fù)了細(xì)胞活性。

對(duì)于細(xì)胞的成骨功能，qPCR結(jié)果和茜素紅染色結(jié)果也證明Sal B進(jìn)一步恢復(fù)了MC3T3-E1細(xì)胞的分化和礦化功能。本研究檢測(cè)的成骨分化相關(guān)基因中，ALP和OCN分別是早期和晚期成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物，Col-I是骨組織基質(zhì)的主要成分，與早中期的成骨分化密切相關(guān)，而RUNX2作為其他分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在成骨細(xì)胞分化和骨形成中起關(guān)鍵作用。同時(shí)，研究證明RUNX2是WNT/β-catenin信號(hào)通路的直接靶標(biāo)，該信號(hào)通路的激活可直接激活RUNX2啟動(dòng)子，從而促進(jìn)相關(guān)成骨分化基因的表達(dá)[22]。由此可以推測(cè)β-catenin蛋白對(duì)RUNX2的正向調(diào)節(jié)與Sal B對(duì)成骨細(xì)胞成骨功能的恢復(fù)有著必然聯(lián)系。而Sal B如何影響WNT/β-catenin信號(hào)通路，β-catenin如何調(diào)節(jié)下游的成骨分化，需要今后更多的實(shí)驗(yàn)研究。

圖6 Sal B恢復(fù)MC3T3-E1細(xì)胞礦化功能

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為Sal B抑制氧化應(yīng)激微環(huán)境下成骨細(xì)胞內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生，預(yù)防和修復(fù)成骨細(xì)胞的氧化損傷提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。當(dāng)然，關(guān)于Sal B對(duì)成骨細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索，而且我們也希望通過(guò)動(dòng)物模型對(duì)Sal B的藥理作用進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為探討Sal B對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者的防治作用的應(yīng)用前景提供了前期的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望為臨床上各類(lèi)氧化應(yīng)激微環(huán)境下的成骨修復(fù)及種植體的骨整合提供新型治療途徑和方向。