呂敏，蔡祖仁，陳肖鳴

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325015）

人類婆羅雙樹樣基因（SALL4）是spalt樣（SALL）基因家族（SALL1～4）的成員之一，最初克隆是基于其DNA序列與果蠅同源基因spalt（sal）1，2，3同源，主要參與胚胎的發(fā)育[1]。SALL4是一種鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，在維持胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的多能性和自我更新方面起著至關(guān)重要的作用[2]。出生后，SALL4的表達(dá)下調(diào)，在大多數(shù)成年組織中缺失。然而大量研究發(fā)現(xiàn)，SALL4在惡性腫瘤卻恢復(fù)表達(dá)，SALL4的異常表達(dá)通過維持腫瘤干細(xì)胞的特性，促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。自從SALL4首次作為癌基因在白血病中被發(fā)現(xiàn)后，SALL4的功能已經(jīng)在各種類型的癌癥中得到了研究[4]。目前在肺癌、乳腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞中，SALL4已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)細(xì)胞活力、凋亡和致瘤性[5-8]。到目前為止，SALL4在兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞中的作用鮮見報道。因此，本研究通過分析干擾SALL4的表達(dá)對兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞體外增殖、凋亡的影響，進(jìn)一步明確SALL4與兒童睪丸卵黃囊瘤的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體：成品pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA干擾載體購于上海吉瑪生物公司，包含針對951干擾位點的1條特異性干擾序列（5’-GACCGUUCCAGUGU AAGAUTT-3’）和1條陰性干擾序列（5’-GTTCTCCGAACGT GTCACGT-3’）[9]。

1.1.2 細(xì)胞：利用原代組織培養(yǎng)技術(shù)對手術(shù)切除的1例兒童睪丸卵黃囊瘤標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過連續(xù)培養(yǎng)，初步建立起卵黃囊瘤細(xì)胞系，并對其生物學(xué)進(jìn)行鑒定[10-11]。

1.1.3 主要試劑：RNA抽提Trizol、Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基均購于美國Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基、FBS購于美國Gibco公司，RT-PCR試劑盒購于美國Thremo公司，SYBR Green PCR Master Mix購于大連寶生物公司，SALL4一抗、辣根標(biāo)記鼠二抗購于美國Abcam公司，GAPDH一抗購于美國Bioworld公司，CCK-8試劑購于日本DOJINDO公司，流式細(xì)胞術(shù)試劑盒購于美國Sigma公司，其余試劑為實驗室常備。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：所有細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃，5% CO2。轉(zhuǎn)染前1 d取對數(shù)期生長（細(xì)胞80%～90%融合）的細(xì)胞，以2×105/孔接種于無菌6孔板。實驗分3 組：空白對照組、陰性對照組、SALL4干擾組。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測：待轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，提取總RNA。嚴(yán)格按照說明書用反轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在RT-PCR儀上進(jìn)行擴增，選用GAPDH作為內(nèi)參。各基因引物如下：SALL4引物（正向引物5’-CCGCACTGAGATGGAAGGT-3’，反向引物5’-GCTGGGCTGCTAACAAAGG-3’，合成產(chǎn)物大小 143 bp）；GAPDH引物（正向引物5’-TTGGCTACAGCAAC AGGGTG-3’，反向引物5’-TCTACATGGCAACTGTGAGGA G-3’，合成產(chǎn)物大小182 bp）。 擴增反應(yīng)條件為95 ℃， 3 min；95 ℃，15 s，62 ℃，30 s，72 ℃，30 s，進(jìn)行40 循環(huán)。實時熒光定量PCR以綠色熒光染料SYBR Green作為檢測試劑，循環(huán)結(jié)束后，通過對溶解曲線的分析，鑒定擴增產(chǎn)物的特異性，用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)：取轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，用冰PBS沖洗3次，用RIPA裂解液在冰上裂解30 min后，12 000 r/min離心1 min，取上清液上樣，BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司）測定蛋白濃度。用8% SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的變性蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉或BSA在室溫下封膜1 h后，與鼠抗人SALL4一抗（1:500）結(jié)合，4 ℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（1:5 000）室溫孵育2 h后TBST洗膜。加入ECL發(fā)光反應(yīng)液，暗室顯影定影后曝光，掃描入計算機。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測：CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力。取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以104/孔接種于無菌96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。于接種12、24、48、72 h后，分別加入含10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基，孵育1～3 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測各孔的OD值。分3個實驗組，分別為空白對照組、陰性干擾組、SALL4干擾組，設(shè)置5個復(fù)孔，去掉每組5個復(fù)孔中的最大值和最小值，將各孔的OD值減去本底OD值（不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基加CCK-8試劑），統(tǒng)計OD值作為細(xì)胞增殖活力值。繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測：細(xì)胞經(jīng)不含EDTA的胰酶消化和離心后，加入400 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞液中，用An-nexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色，在BD FACS Arial II流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間兩兩比較采用方差檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SALL4干擾結(jié)果檢測 分別在mRNA和蛋白水平驗證SALL4的干擾結(jié)果。SALL4干擾組的mRNA水平（24.0%±4.0%）較陰性對照組（93.0%±43.0%）顯著下降（P＜0.05），SALL4干擾組的SALL4蛋白相對表達(dá)量（0.39±0.10）較陰性對照組（1.02±0.09）顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 干擾SALL4對兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實驗結(jié)果表明，干擾SALL4后兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的增殖活力顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 干擾SALL4對兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞凋亡的影響 SALL4干擾組的細(xì)胞凋亡率（72.50%±1.02%）明顯高于陰性對照組（66.63%±2.99%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SALL4干擾組的細(xì)胞凋亡率與空白對照組（70.40%±0.75%）比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.213），見圖2。

圖1 干擾SALL4后兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的SALL4 mRNA和蛋白相對表達(dá)量

表1 干擾SALL4對兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞增殖的影響（OD值，每組n=3，）

表1 干擾SALL4對兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞增殖的影響（OD值，每組n=3，）

與陰性對照組比：aP ＜0.05

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圖2 干擾SALL4對兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

兒童原發(fā)性睪丸腫瘤很少見，占兒童實體腫瘤的1%，年發(fā)病率為0.5～2/10萬男孩[12-13]。大約有75%的兒童睪丸腫瘤為惡性，其中以卵黃囊腫瘤最常見。卵黃囊瘤由胚胎外系生殖細(xì)胞異常分化而形成的，又稱為內(nèi)胚竇瘤，其惡性程度高，病情進(jìn)展快，預(yù)后較差，如不盡早干預(yù)，常較快發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中多以血行轉(zhuǎn)移為主[14]。目前治療主要以早期手術(shù)完整切除腫瘤輔以化療，但遠(yuǎn)期效果并不理想。隨著目前腫瘤靶向治療的研究日益深入，越來越多的證據(jù)證實基因干擾可作為一種潛在的方法用于腫瘤的治療。

ESCs以其強大的多能性而聞名，能夠在人體內(nèi)分化為大于220種細(xì)胞類型[15-16]。SALL4是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，屬于SALL基因家族，位于20號染色體上，它與果蠅spalt序列同源，是胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性維持的關(guān)鍵因子。SALL4在胚胎發(fā)育過程中逐漸下降，隨著組織的成熟而沉默[17]。但迄今為止，在十多種實體腫瘤如肺癌、肝癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌和幾種常見白血病中均發(fā)現(xiàn)了SALL4的異常高表達(dá)[5，18-20]。越來越多的證據(jù)表明，高水平的SALL4表達(dá)與惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，包括促進(jìn)轉(zhuǎn)移、增殖，故而SALL4被認(rèn)為一種新的原癌基因[21]。YANG[22]報道，下調(diào)SALL4的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖。另一項研究證明，SALL4表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。PAN等[24]發(fā)現(xiàn)SALL4激活長鏈非編碼RNA DANCR促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。CAO 等[25]通過對睪丸腫瘤的免疫學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其在典型精原細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞胚胎性癌和卵黃囊瘤中均呈高表達(dá)。同時有學(xué)者針對兒童卵黃囊瘤標(biāo)志物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)相比傳統(tǒng)的AFP標(biāo)志物，SALL4是一個具有較高特異性和敏感性的腫瘤標(biāo)志物[26]。盡管有報道稱SALL4的異常表達(dá)會影響各種癌癥的發(fā)生和預(yù)后，但是在兒童睪丸卵黃囊瘤中的作用尚不清楚。

本研究設(shè)計靶向SALL4的干擾載體并轉(zhuǎn)染兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞，采用體外研究的方法觀察干擾SALL4表達(dá)對兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，從而探討SALL4在兒童睪丸卵黃囊瘤發(fā)生中的作用機制。本研究證實在兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞中干擾SALL4后，抑制了細(xì)胞中SALL4 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制SALL4蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞增殖明顯下降，細(xì)胞數(shù)量減少。同時發(fā)現(xiàn)SALL4表達(dá)下調(diào)后在細(xì)胞的早期凋亡水平顯著升高，抑制SALL4可能會促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的增殖。然而，其發(fā)生機制仍不明確。細(xì)胞凋亡是一個多步驟過程，受到各種功能基因的調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)的幾種經(jīng)典的致瘤途徑如Wnt/β-catenin、PTEN、Bmi-1等均與SALL4的表達(dá)有關(guān)[27]，我們猜測SALL4通過對以上某些經(jīng)典凋亡通路的調(diào)節(jié)，從而在兒童睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的進(jìn)展和預(yù)后中起著關(guān)鍵的中介作用（這也將是我們下一步的研究重點），因此我們的研究表明，SALL4可作為兒童睪丸卵黃囊瘤生物治療一個可能的潛在靶點。