李辰璐，方錦霞，羅京，朱小春，王曉冰

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 風濕免疫科，浙江 溫州 325015）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種主要累及脊柱、骶髂關(guān)節(jié)等中軸關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)等外周關(guān)節(jié)的慢性炎癥性疾病。其主要的病理改變是附著點炎，嚴重者會出現(xiàn)骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞，甚至關(guān)節(jié)融合強直，對患者的生活帶來嚴重的危害。在全球范圍，AS的發(fā)病率為1.0%～1.4%[1]，與遺傳背景密切相關(guān)。

AS的易感等位基因人類白細胞抗原B27（human leukocyte antigen B27，HLA-B27）的陽性率分布與全球的發(fā)病率分布相一致[2]，它是迄今為止已知的復雜疾病中相關(guān)性最強的一個等位基因[3]。此外，全基因組研究發(fā)現(xiàn)某些非HLA易感基因在AS的發(fā)展中起重要作用[4]。轉(zhuǎn)錄組是由基因組轉(zhuǎn)錄的一系列RNA分子組成，包括mRNA、tRNA、rRNA和其他的調(diào)節(jié)非編碼RNAs。與基因組不同，轉(zhuǎn)錄組是動態(tài)的，伴隨著個體的生命進程不停地變化進展，而且還會針對環(huán)境刺激和內(nèi)部生物信號做出快速的反應(yīng)。這些基因的差異表達和調(diào)節(jié)是真核生物細胞分化的基礎(chǔ)，擴展了靜態(tài)的基因組的視野，使機體內(nèi)不同類型的細胞能表達出完全不同的功能[5]。在人類疾病的研究中，比較基因表達的分析為疾病的遺傳學研究提供了的重要信息。通過上調(diào)或者下調(diào)它們的表達成分即能決定有無患病群體的表型差異。

對AS患者血標本的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)炎癥作用基因以及調(diào)節(jié)軟骨和骨代謝的候選基因[6]。來自Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫的分析證明了AS患者較對照者高表達的差異基因主要富集在抗原加工和抗原提呈，細胞因子受體相互作用、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等通路[7-8]。根據(jù)現(xiàn)有研究，除ERAP1、IL23R和RUNX3的少數(shù)基因確認與AS發(fā)病過程相關(guān)，還需要更進一步的研究來確認這些通路在疾病過程中的參與以及發(fā)掘更多相關(guān)基因[9]。然而，不同地域和人種的遺傳背景具有多樣性[10]。AS之前的轉(zhuǎn)錄組研究大多針對非漢族人群。本研究旨在通過探討漢族人群AS患者與正常人轉(zhuǎn)錄組差異，分析AS發(fā)病機制，為治療AS尋找新的靶點。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2017年住院的53例AS患者作為病例組，其中男46例，女7例。同期健康體檢者53例為對照組，男46例，女7例。病例組納入標準：18～70歲且有＞3個月的炎性腰背痛，符合1984年紐約分類標準[11]。排除標準：合并其他免疫系統(tǒng)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合征、類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病性關(guān)節(jié)炎，合并重要臟器功能不全，合并慢性感染性疾?。òㄒ倚筒《拘愿窝?、結(jié)核）、腫瘤、心腦血管疾病、精神障礙等。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受檢者簽署知情同意書。每位受檢者抽取外周血5 mL，加入PBS與淋巴細胞分離液后離心取白膜層，洗滌獲得外周血單核細胞（peripheral blood monocytes，PBMCs）。將從PBMCs樣品中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在 Illumina平臺上測序。

1.2 差異表達基因（differentially expressed gene，DEGs）篩選 使用DEseq2（18）軟件包對RNA-seq數(shù)據(jù)進行標準化，并進行二維主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚 類，以顯示病例組和對照組之間的相似性和差異。使用DEseq2進行差異基因表達分析，如果基因符合以下標準，則該基因被認為是DEGs：DEseq2中的錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05和log2倍變化（FC）＜-1或log2 FC＞1。使用ggplot2軟件包在R軟件中構(gòu)建可視化不同對象之間所有DEG的火山圖，并使用R軟件包pheatmap繪制DEG的熱圖。

1.3 差異表達基因的GO（gene ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析 采用ClueGo插件[12]在Cystoscape[13]中整合了GO術(shù)語，并分別創(chuàng)建了具有上調(diào)基因的生物過程 網(wǎng)絡(luò)。采用Bonferroni法進行校正，P閾值為0.05。信號通路分析在Kobas3.0[14]的在線網(wǎng)站（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn）上進行，包括KEGG途徑、Reactome、BioCyc和PANTHER信號通路分析，并使用GOplot繪圖。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析（protein-protein interaction，PPI） DEGs的PPI數(shù)據(jù)是從用于檢索相互作用基因的搜索工具（STRING）版本11.0（https://www.string-db.org/）[15]下載的數(shù)據(jù)。然后，通過Cytoscape軟件建立并可視化PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用插件MCODE[16]確定DEG的相互關(guān)聯(lián)程度。

1.5 細胞因子分析 本試驗另外入選了30例AS患者及30位健康對照。納入及排除標準同前。所有受檢者簽署知情同意書后抽取外周血5 mL，提取血漿。ELISA法測定患者外周血漿中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ等細胞因子水平。

1.6 統(tǒng)計學處理方法 采用Rv3.6.1 for Linux軟件DEseq2、ggpubr統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。差異基因分析使用Wald檢驗。2組間細胞因子比較使用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AS患者與對照組的基因表達模式差異 使用DEseq2對比AS研究組與對照組基因表達差異，基于標準（P＜0.05 and |logFC|＞1），找到153個DEGs，其中149個基因上調(diào)，4個基因下調(diào)（見圖1）。表明除HLA-B27以外，還有一系列的基因參與了AS的發(fā)病。其中部分基因在既往的文獻報道中提及與AS相關(guān)，如THBD[17]、IL1B[18]、CXCL8[19]、CCL7[20]等。提取基因表達值，繪制層次聚類熱圖以顯示所有的差異DEGs，可以看到2組的基因表達譜存在明顯的差異，見圖2。

圖1 AS中所有DEGs火山圖

圖2 AS組和對照組DEGs熱圖

2.2 AS組與對照組的DEGs涉及的信號通路 對發(fā)現(xiàn)的DEGs進行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)了幾條重要的信號通路，包括細胞因子間相互作用、TNF信號通路A/1（視紫紅質(zhì)樣受體）、GPCR配體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、CCKR信號圖、血液凝固、趨化因子介導的炎癥和細胞因子信號通路等，見圖3。

圖3 DEGs通路圖

2.3 AS組與對照組的DEGs編碼蛋白的相互關(guān)系 對涉及KEGG途徑的DEGs進行了PPI分析。在由STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，大多數(shù)基因，包括CXCL8、IL1B、CXCL1、CCL2、PTGS2、EDN1 和 SERPINE1，與KEGG途徑中涉及的其他DEGs相互作用（見圖4），表明這些基因可能通過相互作用參與AS的發(fā)病。

圖4 通過STRING完成的DEGs的PPI圖

2.4 AS組與對照組的DEGs的生物功能注釋 DEGs在生物學過程（BP）中顯著富集，包括粒細胞遷移（GO：0097530），中性粒細胞遷移（GO：1990266），發(fā)熱過程（GO：0001660）等，這些都起著重要的作用。此外，DEGs在分子功能組（MF）中顯著富集趨化因子受體結(jié)合（GO：0042379）、趨化因子活性（GO：0008009）和過氧化物酶活性（GO：0004601）?？傊?，GO分析的結(jié)果表明，大多數(shù)DEGs在粒細胞遷移、中性粒細胞遷移、發(fā)熱過程、趨化因子活性等相關(guān)，所有這些都可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。見圖5。

2.5 炎性細胞因子差異 為進一步驗證這些炎癥相關(guān)基因?qū)S的作用，對外周血的重要炎癥因子進行驗證，發(fā)現(xiàn)AS組較對照組在IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等外周血炎性細胞因子水平上升（P＜0.05），IL-4因子水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖5 DEGs的ClueGo網(wǎng)絡(luò)分析圖

圖6 2組細胞因子相對表達量（每組n=30）

3 討論

RNA是基因和蛋白之間的關(guān)鍵鏈接，所以轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)締組織疾病的發(fā)病機制及治療靶點研究。本項目通過高通量的RNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)AS患者和健康對照者存在153個DEGs，其中149個基因上調(diào)。而這些基因相互之間密切聯(lián)系，相互作用，共同參與疾病的發(fā)生。生物功能分析提示這些差異基因主要聚集在TNF信號通路、趨化因子信號傳導等炎癥相關(guān)通路。而這個結(jié)果又進一步在外周血中的炎性細胞因子的表達水平得到驗證。

已有研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞分化、INF信號傳導途徑和與這2種信號傳導途徑相關(guān)的基因，特別是 FCGR2B、STAT2、SOCS3、IFIT1 和IFIT3，可能在AS的發(fā)病中發(fā)揮作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)了大量與TNF信號通路相關(guān)的基因，如CXCL3、IL1B、CCL20、CXCL2、 CXCL1、SOCS3、PTGS2 等。已有研究證實TNF信號通路在AS發(fā)病過程中的重要作用，而對TNF-α的特異性抑制劑，也已在臨床上大量使用于AS患者的治療，并取得良好的療效[22]。因此，本研究也為中國漢族人群應(yīng)用該生物制劑提供了一定的理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)在AS患者的外周血細胞中趨化因子/趨化因子受體家族的炎癥因子表達顯著上調(diào)，包括CCL7、CXCL3、CXCL8、CCL2、CCL20、CXCL2、CXCL1。我們對DEGs進行通路分析也發(fā)現(xiàn)這些差異表達的基因集中在趨化因子介導的炎癥及趨化因子與趨化因子受體結(jié)合等通路。生物學功能分析也提示這些基因在粒細胞遷移中的作用。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)趨化因子的定向趨化作用控制著各種免疫細胞到達感染、創(chuàng)傷和異常增殖部位，從而發(fā)揮特定的免疫功能[23]。所有這些都支持AS疾病過程中免疫炎癥的過度活化，也進一步支持AS是一種兼具有炎癥和免疫特色的系統(tǒng)性疾病。

臨床病例的外周血檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α炎癥相關(guān)的關(guān)鍵細胞因子在AS中表達明顯上調(diào)，進一步驗證了測序結(jié)果。文獻報道IL-2、IL-6、TNF-α[24-25]等細胞因子在AS疾病的病理過程中發(fā)揮作用，跟我們的研究結(jié)果相符。因此，這些細胞因子也成為AS治療的靶點，也為細胞因子的生物制劑治療AS提供理論依據(jù)。

本研究的不足是進行RNA測序的樣本數(shù)相對較少，尚未考慮患者的個體差異和疾病的特質(zhì)性，仍需要大樣本的研究以更加全面可靠地證實本研究的結(jié)果。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)的許多可能參與AS疾病過程的DEGs，尚無法確定其具體作用機制，仍需要進一步通過細胞和（或）動物模型進一步探索。

總之，本研究通過對AS和正常人轉(zhuǎn)錄組的研究，發(fā)現(xiàn)了炎癥相關(guān)基因在AS患者中明顯表達上調(diào)，提示這些基因可能參與AS的發(fā)病過程。這些基因主要涉及到TNF信號通路、趨化因子/趨化因子受體等炎癥相關(guān)的重要組成成分和通路。這些信號通路及炎癥因子可成為未來AS診斷標志物和治療靶點。