章洪，王蕭楓，黃淑嫻

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.藥劑科；2.骨科）

傷科消腫止痛膏為溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院傳統(tǒng)的傷科外用藥，由大血藤、雞血藤、紅木香等7味中草藥組成，是老一輩骨傷名家在民間秘方基礎(chǔ)上的集體經(jīng)驗(yàn)結(jié)晶[1]，至今已有40 多年的使用歷史，臨床療效顯著[2]，尤其是對各種筋傷有顯著的消腫止痛功效，在溫州乃至浙南地區(qū)享負(fù)盛名。研究表明，傷科消腫止痛膏對急性軟組織損傷有確切的療效[2]，其抗炎鎮(zhèn)痛的作用明顯優(yōu)于傷科靈[3]，其活血化瘀消腫方面優(yōu)于扶他林軟膏[4-5]。然而其工藝粗糙，制備周期長，難以對藥效成分和主要成分進(jìn)行有效的質(zhì)控。本研究采用正交法對影響中藥提取的4個因素進(jìn)行考察，采用單因素考察法選取合適輔料，并采用HPLC法測定虎杖苷和大黃素的含量。

1 材料和方法

1.1 儀器 Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀，配制四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、DAD檢測器（美國安捷倫公司）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DTY-10A智能恒溫循環(huán)器（北京德天佑科技發(fā)展有限公司）；101-AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZF6050AB真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；JCS-600電子天平（金華凱豐集團(tuán)有限公司）；CP214電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；S10-3型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 虎杖苷對照品（批號DS170309-038，純度98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司），大黃素對照品（批號DST161212-030，純度98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司），明膠（批號2091044，江門羅賽洛明膠有限公司），阿拉伯膠（批號170301，鄂州葛店人福藥用輔料有限公司），甘油（批號20170801，南昌白云藥業(yè)有限公司），苯甲酸鈉（批號20170309，長沙華日制藥有限公司），月桂氮卓酮（批號170202，天門科捷制藥有限公司），乙腈、甲醇（色譜純）；其他試劑均為分析純。雞血藤（批號161201，產(chǎn)地浙江）、大血藤（批號170101，產(chǎn)地浙江）、紅木香（批號160920，產(chǎn)地云南）、虎杖（批號161101，產(chǎn)地浙江）、梔子根（批號160901，產(chǎn)地浙江）購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司；生川烏（批號160719，產(chǎn)地四川）、生草烏（批號160701，產(chǎn)地浙江）購自杭州華東中藥飲片有限公司；飲片均由溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。

1.3 提取工藝

1.3.1 醇提工藝：取雞血藤、大血藤、虎杖、梔子根和紅木香五味藥，在進(jìn)行了單因素考察的前提下，采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，以溶劑用量（A）、提取時間（B）、乙醇濃度（C）、提取次數(shù)（D）為影響因素，選用虎杖苷、大黃素和干膏的得率的綜合評分為指標(biāo)，進(jìn)行條件優(yōu)選，因素及水平見表1。

表1 L9(34)因素水平表

1.3.2 水提工藝：取生川烏和生草烏適量，加入7倍量的水，提取2次，每次2 h，合并提取液，過濾，濃縮至相對密度1.03（50 ℃），備用。將醇提液與水提液混合，即得傷科消腫止痛膏提取液。

1.4 制備工藝

1.4.1 制備：取明膠和阿拉伯膠加入傷科消腫止痛膏提取液適量，水浴60 ℃溶解，攪拌均勻，再加入苯甲酸鈉和甘油適量，攪拌均勻，當(dāng)水浴溫度降至40 ℃時，加入氮酮，攪拌均勻，涂布在無紡布上，待其冷卻凝固即得傷科消腫止痛膏。

1.4.2 單因素考察：采用單因素考察法，分別考察明膠與阿拉伯膠的比例（1:1、4:1、1:4）和傷科消腫止痛膏提取液的加入量（10、15、20 mL）。

1.5 含量測定

1.5.1 色譜條件：大黃素采用色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.1%磷酸水溶液-甲醇（20:80）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長254 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

虎杖苷采用色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，15% B；10～30 min，15%～30% B）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長306 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

1.5.2 對照品溶液的制備：精密稱取大黃素對照品適量，加甲醇定容，即得大黃素對照品溶液。精密稱取虎杖苷對照品適量，加稀乙醇定容，即得虎杖苷對照品溶液。

1.5.3 供試品溶液的制備：取傷科消腫止痛膏適量，去除無紡布，精密稱定，精密加入三氯甲烷 25 mL和2.5 mol·L-1硫酸溶液20 mL，稱量，置80 ℃ 水浴中加熱回流2 h，冷卻至室溫，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失重量，搖勻。分取三氯甲烷液，精密量取10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得大黃素供試品溶液。

取傷科消腫止痛膏適量，去除無紡布，精密稱定，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流 30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得虎杖苷供試品溶液。

1.5.4 陰性溶液的制備：按提取工藝和制備工藝制備不含虎杖的傷科消腫止痛膏，按供試品溶液制備方法分別制備大黃素陰性溶液和虎杖苷陰性溶液。

1.5.5 專屬性考察：吸取對照品溶液、供試品溶 液、陰性溶液適量，運(yùn)用本研究色譜條件進(jìn)樣測定。

1.5.6 線性關(guān)系考察：精密吸取虎杖苷和大黃素對照品溶液適量，稀釋成一系列質(zhì)量濃度的對照品溶液（虎杖苷：0.006、0.020、0.059、0.178、0.533、1.600 mg·mL-1；大黃素：0.014、0.041、0.123、 0.370、0.740 mg·mL-1）。運(yùn)用本研究色譜條件對虎杖苷和大黃素進(jìn)行檢測。

1.5.7 精密度試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，運(yùn)用本文色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。

1.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，運(yùn)用本文色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

1.5.9 重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取同一批供試品溶液，6份，運(yùn)用本研究色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

1.5.10 加樣回收試驗(yàn)：取傷科消腫止痛膏適量12份，去除無紡布，精密稱定，分別加入大黃素和虎杖苷對照品適量，按1.5.3 項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。

2 結(jié)果

2.1 提取工藝 按處方量稱取各藥材適量，按正交設(shè)計(jì)表所列條件回流提取，測定虎杖苷和大黃素的得率以及干膏得率，并計(jì)算。結(jié)果=干膏得率/最大干膏得率×20+虎杖苷得率/最大虎杖苷得率×40+大黃素得率/最大大黃素得率×40。

直觀分析IA＞IIA＞IIIA，IIIB＞IIB＞IB，IIC＞ IC＞IIIC，IIID＞IID＞ID，RD＞RC＞RB＞RA。方差分析 A為誤差項(xiàng)，B、C、D對指標(biāo)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2-3。所以最佳醇提工藝為D3C2B3A1，考慮到節(jié)約時間和成本，故最終最佳醇提工藝為 D3C2B2A1，即7倍體積的70%乙醇溶液，提取3次，每次2 h。

確定提取工藝為：雞血藤等五味藥用7倍體積的70%乙醇溶液，提取3次，每次2 h，合并提取液，過濾，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.03（50 ℃）；生川烏和生草烏用7倍量的水，提取2次，每次2 h，合并提取液，過濾，濃縮至相對密度1.03（50 ℃）。合并醇提液與水提液即得傷科消腫止痛膏提取液。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.2 制備工藝 由表4可知，明膠與阿拉伯膠的比例為1:4，兩者質(zhì)量總和與傷科消腫止痛膏提取液的比例為1:3時，所得膏體內(nèi)外黏度適中。

確定制備工藝為以1:4的比例取明膠和阿拉伯膠適量，混合均勻，加入3倍量傷科消腫止痛膏提取液，水浴60 ℃溶解，攪拌均勻，再加入苯甲酸鈉和甘油適量，攪拌均勻，當(dāng)水浴溫度降至40 ℃時，加入氮酮適量，攪拌均勻，涂布在無紡布上，待其冷卻凝固即得傷科消腫止痛膏。

表4 制備工藝

2.3 含量測定

2.3.1 專屬性考察：在本研究色譜條件下，2種成分均能基線分離，供試品中虎杖苷和大黃素的保留時間與對照品中色譜峰的保留時間相符，在陰性溶液中均無干擾峰（見圖1-2）。

2.3.2 線性范圍：以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程：虎杖苷Y=20164X- 39.865（r=0.9999），在0.006～1.600 mg·mL-1線性關(guān)系良好；大黃素Y=20394X-4.5931（r=0.9996），在0.014～0.740 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收實(shí)驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次，虎杖苷的RSD為0.870%，大黃素的RSD為0.851%，表明儀器精密度良好。室溫下放置24 h，虎杖苷的RSD為0.786%，大黃素的RSD為0.719%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。同一批樣品進(jìn)樣檢測，虎杖苷的RSD為2.154%，大黃素的RSD為2.811%，表明本方法重復(fù)性良好?；⒄溶蘸痛簏S素加樣回收率在（100±5）%以內(nèi)，符合要求，見表5。

2.3.4 工藝驗(yàn)證：按處方配比取各藥材共650 g，按提取工藝和制備工藝制備傷科消腫止痛膏3批，虎 杖苷的得率分別是2.30%、2.34%、2.20%，RSD值為3.085%；大黃素的得率分別是0.72%、0.86%、0.76%，RSD值為9.415%；平均每克含虎杖苷12.71 μg，含大黃素4.14 μg。符合要求，該工藝可用于大批量制備。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 處方中虎杖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完整，其主要藥效成分大黃素和虎杖苷均有完整的定性定量檢測手段[7-8]。大黃素具有抑菌抗炎及免疫調(diào)節(jié)抗氧化等作用，對多種血管有舒張作用，能改善微循環(huán)，抑制血小板聚集，降低血液黏度[9-10]；虎杖苷具有抗菌抗病毒抗炎抗過敏的作用，對血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性有著重要作用，從而維持血管通透性、免疫防御以及炎癥反應(yīng)[11-12]。研究之初，也考慮過紅景天苷和芒柄花素作為檢測成分，但在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紅景天苷難以有效分離，芒柄花素含量太低，故舍棄，最終選擇大黃素和虎杖苷作為指標(biāo)成分。

圖1 虎杖苷高效液相色譜圖

圖2 大黃素高效液相色譜圖

表5 加樣回收率

干膏是中藥提取物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，干膏的得率的大小對有效成分的得率和制劑臨床療效有著一定的影響，在醇提工藝的正交試驗(yàn)中，確定干膏得率、大黃素得率、虎杖苷得率的權(quán)重系數(shù)為20:40:40。實(shí)驗(yàn)以2個藥效成分和干膏得率為指標(biāo)成分對醇提工藝進(jìn)行綜合評價，符合中藥復(fù)方的整體觀。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)水平選擇 實(shí)驗(yàn)之初，采用單因素法分別考察了乙醇濃度和提取次數(shù)對藥效成分得率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，70%乙醇對2種藥效成分都具有較好的提取效果，故選擇50%、70%、90%作為乙醇 濃度的3個水平。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過3次提取，大黃素已難以檢測，虎杖苷峰面積下降了14倍，可忽略不計(jì)，故選擇1次、2次、3次作為提取次數(shù)的3個水 平。

3.3 大黃素轉(zhuǎn)移率 按藥典方法測定同批次虎杖藥材中大黃素的含量為20.4%，五味藥材合煎后，大黃素的得率僅0.611%，轉(zhuǎn)移率僅3.00%，說明在提取過程中大部分大黃素轉(zhuǎn)化為其他成分，具體轉(zhuǎn)化為何種成分，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

本研究建立的傷科消腫止痛膏制備工藝，操作簡單，過程可控，對提高傷科消腫止痛膏藥效的穩(wěn)定性有一定的作用，可用于大批量生產(chǎn)。