王苗苗 陳依春 白曉潔 馬瑞君 封啟龍

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

心律失常是缺血性心血管疾病常見的一種臨床表現(xiàn)，是心源性猝死的主要原因(約占80%)[1]，其中室速、室顫等惡性心律失常尤為多見。目前臨床應(yīng)用的抗心律失常藥物大多屬于廣譜性離子通道阻斷劑，在發(fā)揮治療心律失常作用的同時(shí)，可能存在潛在的致心律失常風(fēng)險(xiǎn)[2]。鈉-鈣交換體(Na+-Ca2+exchanger,NCX)在心肌細(xì)胞上高度表達(dá)，是維持心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的重要離子交換體，在大多數(shù)情況下，NCX將鈉離子和鈣離子以3∶1的比例逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究證實(shí)，缺血性心臟病中，鈉-鈣交換體功能上調(diào)導(dǎo)致鈣超載，由前向鈉-鈣交換產(chǎn)生的內(nèi)向電流是引起心律失常的重要原因，因而與缺血性心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[3,4]。

心臟NCX包括位于N端的α-1和C端的α-2兩個(gè)肽段，其中α-2肽段是由第7跨膜片段、第8跨膜片段的胞內(nèi)部分以及7、8跨膜片段之間的連接環(huán)組成[5]。研究表明，α-2序列在不同種屬的NCX分子間以及同一種屬不同亞型NCX間高度保守[6]。大量研究表明[7,8]，α-2肽段是NCX 發(fā)揮功能的關(guān)鍵肽段。基于此，本研究擬選用化學(xué)合成的NCXα-2(840-877)肽段，免疫小鼠制備抗NCX 單克隆抗體。α-2(840-877)抗原肽段對(duì)應(yīng)于NCX分子第840～877位氨基酸殘基，由于其本身分子較小(約3.79 kD)，免疫原性相對(duì)較弱，故采用與血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)的方法免疫小鼠制備抗體。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察該抗體預(yù)處理對(duì)結(jié)扎冠脈前降支導(dǎo)致的缺血性心律失常的作用。為分析其作用機(jī)制，利用膜片鉗技術(shù)觀察抗體對(duì)大鼠心肌細(xì)胞NCX正向和反向電流的影響。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c小鼠，雌性6～8周齡，SD大鼠，雄性，240 g左右，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。NCX α-2重復(fù)序列840～877肽段(第840～877位序列為ALGTSVPDTFASKVAATQDQYADASIGNVTGSNAVNVF)(上海吉爾生化有限公司)。試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，F(xiàn)BS(cellmex)，弗氏佐劑、Ouabain、taurine、K2-ATP、Nifedipine、4-AP、L-Glutamic等(美國(guó)Sigma公司)，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)；膠原酶P(德國(guó)Bochringer Mannhein公司)；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純藥品。臺(tái)氏液、酶液、KB液、Na+/Ca2+交換電流(INa/Ca)細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)液(mmol/L)的配制:見參考文獻(xiàn)[5]。主要儀器：抗原親和柱(Phamacia)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)，CO2恒溫孵育培養(yǎng)箱(美國(guó)Themo公司)，灌流裝置(美國(guó)Ala Scientific Instruments Inc公司)，膜片鉗儀器(美國(guó)Axon Instruments公司)，Langendorff心臟灌流裝置(澳大利亞AD Instruments公司)。

1.2方法

1.2.1NCX α-2(840-877)肽段與載體蛋白KLH偶聯(lián)與免疫 將KLH與交聯(lián)劑SMCC混合，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)30 min，使KLH充分活化。用多肽偶聯(lián)緩沖液平衡的SephadexG-25柱層析除去游離成分。將多肽加入已活化的KLH中室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2 h，偶聯(lián)好的產(chǎn)物作為抗原用來免疫動(dòng)物[9]。免疫動(dòng)物前取一定量偶聯(lián)抗原與弗氏完全佐劑(首次免疫)或不完全佐劑(加強(qiáng)免疫)充分混勻?yàn)榉€(wěn)定的乳狀液，于第1、21、35天用肌肉注射法主動(dòng)免疫BALB/c小鼠。免疫后第7天取少許小鼠尾靜脈血檢測(cè)血清效價(jià)。

1.2.2細(xì)胞融合與抗體篩選 選取免疫血清效價(jià)高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。融合前3 d再加強(qiáng)免疫1次。無菌分離免疫鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液后與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。第30天運(yùn)用間接ELISA法進(jìn)行陽性克隆篩選、3次亞克隆后獲得陽性克隆株。將雜交瘤細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3腹水型單抗制備與鑒定 采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備腹水型單抗。BALB/c小鼠腹腔注射石蠟油預(yù)處理1～2周后，每只小鼠腹腔接種(1～2)×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，隨細(xì)胞在腹腔增殖，2～3周后可見小鼠腹部明顯膨隆，產(chǎn)生大量含有單克隆抗體的腹水。腹水經(jīng)抗原親和柱純化后運(yùn)用間接ELISA法和SDS-PAGE法進(jìn)行抗體效價(jià)和抗體濃度的檢測(cè)。

1.2.4大鼠離體缺血性心律失常的記錄 55 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開胸游離心臟后懸掛于Langendorff灌流裝置上，以臺(tái)氏液37℃恒溫經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流心臟，待心臟穩(wěn)定后記錄心電圖。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，造成局部缺血30 min，統(tǒng)計(jì)30 min期前收縮發(fā)生的個(gè)數(shù)，室速和室顫的發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分為3組：①偽手術(shù)組(Sham)：LAD下只穿線不結(jié)扎，臺(tái)式液持續(xù)灌流；②缺血組(Ischemia)：結(jié)扎LAD 30 min，臺(tái)式液持續(xù)灌流；③抗體預(yù)處理+缺血組：結(jié)扎LAD 前5 min改用含10 μg/ml NCX-3F10抗體的臺(tái)式液灌流。

1.2.5大鼠在體缺血性心律失常的記錄 55 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定于鼠板后行氣管插管，BL420生物機(jī)能系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖。在心尖搏動(dòng)處分離胸部肌肉，在左側(cè)第3～4肋間做0.5 cm切口，暴露心臟。于左心耳根部邊緣約2 mm 處以縫合線下穿LAD并結(jié)扎，缺血15 min，心電圖顯示ST段抬高(≥ 0.15 mV)為缺血結(jié)扎成功。統(tǒng)計(jì)15 min期前收縮發(fā)生的個(gè)數(shù)，室速和室顫的發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分為3組：①偽手術(shù)組(Sham)：LAD下只穿線不結(jié)扎，尾靜脈注射1 ml生理鹽水；②缺血組(Ischemia)：結(jié)扎LAD 15 min；③抗體預(yù)處理+缺血組：結(jié)扎LAD 前5 min尾靜脈注射50 μg/kg NCX-3F10抗體。

1.2.6大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離 參照本實(shí)驗(yàn)室建立的分離方法[10]。大鼠麻醉后，快速開胸游離心臟，修剪后經(jīng)主動(dòng)脈逆行懸掛于Langendorff灌流裝置上并固定，臺(tái)式液恒溫恒壓灌流心臟8 min后換為酶液循環(huán)灌流15 min，待心室肌發(fā)白后剪取心尖組織于KB液中剪碎吹打，200目銅網(wǎng)過濾得到單個(gè)心室肌細(xì)胞，室溫靜置2 h左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.7NCX α-2(840-877)抗體3F10對(duì)正常心肌細(xì)胞INa/Ca的作用 將2滴細(xì)胞置于細(xì)胞槽中，貼壁5 min，臺(tái)式液灌流3 min。鏡下選取折光好、紋理清晰的短桿狀單個(gè)心室肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。玻璃微電極充灌內(nèi)液后，進(jìn)入標(biāo)本槽中，接觸細(xì)胞膜表面進(jìn)行封接、破膜。Whole Cell狀態(tài)下，鉗制電位為-40 mV，從+60 mV到-120 mV，2 s內(nèi)完成，電壓刺激的速率為90 mV/s，用NiCl2(5.0 mmol/L)特異性地阻斷Na+/Ca2+交換電流，NiCl2阻斷前后的電流差即為Ni2+敏感Na+/Ca2+交換電流。

2 結(jié)果

2.1單克隆雜交瘤細(xì)胞株的建立 以與KLH偶聯(lián)的NCX α-2(840-877)肽段為抗原免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合和陽性克隆篩選獲得一株可穩(wěn)定分泌抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將其命名為雜交瘤細(xì)胞3F10。

2.2抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體效價(jià)及純度檢測(cè) 經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備腹水型單抗。ELISA結(jié)果顯示，親和純化后的抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10抗體效價(jià)為1∶40 960。SDS-PAGE凝膠電泳鑒定該抗體純度，結(jié)果如圖1所示，在分子量為25 kD和50 kD左右的位置可見清晰的抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10輕鏈、重鏈條帶，與IgG標(biāo)準(zhǔn)品一致，無雜帶，抗體純化效果良好。經(jīng)Bradford法檢測(cè)3F10抗體濃度為1.62 mg/ml。

圖1 抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10純度檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877) purityNote:1.Protein marker;2.Purified antibody 3F10 against NCX α-2(840-877).

2.3抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10對(duì)離體成年大鼠心臟缺血性心律失常的抑制作用 研究結(jié)果顯示，缺血前給予NCX-3F10抗體(10 μg/ml)預(yù)處理后可明顯抑制大鼠離體心臟缺血性心律失常的發(fā)生。與偽手術(shù)組相比，缺血組大鼠100%發(fā)生室速，77.78%出現(xiàn)室顫(P<0.05)。缺血前給予NCX-3F10抗體預(yù)處理后，大鼠的室速發(fā)生率下降至25%，室速的持續(xù)時(shí)間也有明顯的縮短(P<0.05)，見表1。

圖1 抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10純度檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877) purityNote:1.Protein marker;2.Purified antibody 3F10 against NCX α-2(840-877).

2.4抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10對(duì)成年大鼠在體心臟缺血性心律失常的抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血前給予NCX-3F10抗體(50 μg/kg)預(yù)處理后可明顯抑制麻醉大鼠缺血性心律失常的發(fā)生。與偽手術(shù)組相比，缺血組大鼠100%發(fā)生室性心律失常，以頻發(fā)的室早、室速、室顫為主(P<0.05)。缺血前給予NCX-3F10抗體預(yù)處理后，與模型組相比，大鼠室速、室顫的發(fā)生率、持續(xù)時(shí)間和室早的數(shù)目均明顯減少(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10對(duì)大鼠在體心臟缺血性心律失常的影響Tab.2 Effects of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877) on ischemia-induced rat arrhythmias in vivo

圖2 抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10對(duì)在體大鼠心臟缺血性心律失常的抑制作用Fig.2 Inhibition of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877)on ischemia-induced arrhythmias in vivo in ratsNote:A.ECG tracings in rats of different groups.3F10.Tracing from antibody 3F10(50 μg/kg)-preconditioned experiment;B:a.Normal ECG tracing;b.Premature ventricular beats(VPB);c.Ventricular tachycardia(VT);d.Ventricular fibrillation(VF)；3F10.Anti-α-2(840-877) antibody-3F10.

2.5抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉-鈣交換電流(INa/Ca)的抑制作用 研究結(jié)果顯示，NCX-3F10(10 μg/ml)抗體對(duì)INa/Ca有顯著抑制作用。當(dāng)鉗制電位為+50 mV時(shí)，外向鈉-鈣交換電流由(3.23±0.05)降至(2.14±0.03)pA/pF(n=6，P<0.05)；當(dāng)鉗制電位為-100 mV時(shí)，內(nèi)向鈉-鈣交換電流由(-5.57±0.13)降至(-3.41±0.06)pA/pF(n=6，P<0.05)，見圖3。

圖3 抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞的Na+/Ca2+交換電流的抑制作用Fig.3 Inhibition of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877)on Na+/Ca2+ exchange current(INa/Ca) in rat ventricular myocytesNote:A.Current-voltage relationship before(a,control)and after(b) application of 10 μg/ml antibody against α-2(840-877)，after (c) application of 5.0 mmol/L NiCl2;B.Ni2+ sensitive INa/Ca before(a-c)and after(b-c)application of 10 μg/ml antibody against α-2(840-877).

3 討論

在哺乳動(dòng)物中，NCX包括NCX1、NCX2、NCX3三種亞型，分布在多種組織細(xì)胞膜上。根據(jù)心肌細(xì)胞NCX 10次跨膜的新式結(jié)構(gòu)模型[11]，NCX第7次跨膜段之后的α-2重復(fù)序列可能暴露于細(xì)胞膜外側(cè)。NCX分子內(nèi)部α-2重復(fù)序列的高度保守性提示[12]，α-2肽段在NCX的離子轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中化學(xué)合成的免疫原是由38個(gè)氨基酸組成的NCX α-2(840-877)肽段，其分子量?jī)H為3.79 kD，免疫原性也相對(duì)較弱。有文獻(xiàn)報(bào)道，將小分子多肽與血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)后，可顯著增加其免疫原性[13]。本研究為提高NCX α-2(840-877)抗原肽段的免疫原性，將血藍(lán)蛋白KLH與NCX α-2(840-877)肽段進(jìn)行偶聯(lián)后免疫BALB/c小鼠，獲得了穩(wěn)定分泌抗NCX α-2(840-877)單克隆抗體3F10的雜交瘤細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究該抗體功能奠定了基礎(chǔ)。

心律失常是缺血性心血管疾病常見的一種臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人類生命健康。缺血性心律失常主要是由于心肌血供和氧供不足，ATP減少和酸中毒，使心肌細(xì)胞內(nèi)H+增加，進(jìn)而通過Na+-H+交換將H+排出胞外，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+濃度([Na+]i)升高。由于此時(shí)胞內(nèi)ATP減少使鈉-鉀泵活動(dòng)受限，致使細(xì)胞內(nèi)Na+大量蓄積，進(jìn)而激活反向NCX轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)(鈉外排、鈣進(jìn)入)，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載。當(dāng)胞內(nèi)Ca2+增加后，將激活前向模式的鈉-鈣交換活動(dòng)增強(qiáng)，由此產(chǎn)生的一過性內(nèi)向電流是引起后除極和心律失常發(fā)生的重要電生理機(jī)制[14]。本研究利用大鼠離體和在體缺血性心律失常模型證實(shí)，NCXα-2(840-877)肽段的單克隆抗體3F10對(duì)缺血性心律失常具有顯著抑制作用，膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，其抗心律失常作用與該抗體抑制心肌鈉-鈣交換活動(dòng)有關(guān)，這一研究結(jié)果證實(shí)了NCX分子內(nèi)α-2肽段可作為今后治療心律失常的潛在靶點(diǎn)，為今后靶向NCX預(yù)防和治療缺血性心律失常提供了必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為將來開發(fā)抗心律失?？贵w藥物奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。