季列，毛仁玲，孫祥冬，徐軍

膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱腦惡性腫瘤，約35%～60%的顱腦腫瘤為膠質(zhì)瘤[1]。手術(shù)是其主要治療手段，但由于膠質(zhì)瘤具有侵襲性生長(zhǎng)的特征，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后較差。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性增殖是導(dǎo)致病情惡化的主要因素，研究與膠質(zhì)瘤侵襲生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療和評(píng)估患者預(yù)后具有重大意義。Bax蛋白是抑癌蛋白，具有促細(xì)胞凋亡作用，Bax蛋白表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究采用免疫組化法測(cè)定并對(duì)比膠質(zhì)瘤組織與非膠質(zhì)瘤腦組織中的MMP-2、Bax表達(dá)情況，以了解MMP-2、Bax與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2017年6月本院收治的老年膠質(zhì)瘤患者48例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：行手術(shù)治療；術(shù)后經(jīng)組織切片病理檢查確診為膠質(zhì)瘤；臨床資料完整；術(shù)前未接受過(guò)任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴自身免疫性疾病；合并其他惡性腫瘤；嚴(yán)重肝、腎、心、肺功能障礙；凝血功能障礙。其中男28例，女20例；年齡52～78歲，平均（65.62±2.87）歲；瘤體直徑1.3～5.3 cm，平均（2.52±0.75）cm；病灶位于額葉22例，顳葉13例，頂葉8例，枕葉5例；病理分期Ⅰ期6例，Ⅱ期12例，Ⅲ期9例，Ⅳ期21例。另選取同期在本院行去骨瓣減壓術(shù)的非腦膠質(zhì)瘤患者30例為對(duì)照組，男17例，女13例；年齡48～76歲，平均（66.54±3.72）歲。2組的性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人MMP-2單克隆抗體和Bax單克隆抗體（購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司）；SP法免疫組化試劑盒（購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 檢測(cè)方法 2組患者均在術(shù)中留取顱腦組織標(biāo)本，觀察組留取腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，對(duì)照組留取相應(yīng)灶周腦組織標(biāo)本。所有標(biāo)本都在手術(shù)切除后10 min內(nèi)，使用濃度為10%的甲醛溶液進(jìn)行固定，石蠟包埋、連續(xù)切片（厚度3 μm）。脫蠟、酒精梯度水化，然后使用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。室溫冷卻，PBS沖洗，一抗室溫孵育，再次PBS沖洗，二抗37℃孵育，PBS洗滌，DAB顯色后沖洗，再?gòu)?fù)染、脫水、封片。記錄患者臨床特點(diǎn)，隨訪至患者死亡，記錄中位生存期。

1.2.3 結(jié)果判斷 MMP-2、Bax均為細(xì)胞質(zhì)著色，細(xì)胞質(zhì)染色即為陽(yáng)性細(xì)胞。高倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，觀察染色情況，計(jì)數(shù)500個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行半定量計(jì)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例≤5%計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞比例6%～25%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞比例26%～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞比例51%～75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例＞75%計(jì)4分。染色程度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)染色計(jì)0分，染色細(xì)胞呈淡黃色計(jì)1分，染色細(xì)胞呈黃色計(jì)2分，染色細(xì)胞呈棕黃色或褐色計(jì)3分。陽(yáng)性評(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞比例得分×染色程度得分。陽(yáng)性評(píng)分0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～6分為中度陽(yáng)性（++），＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率表示，χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier生存分析法，分析MMP-2、Bax表達(dá)與中位生存期的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組的MMP-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

對(duì)照組MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)0例，Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)25例（83.33%）；對(duì)照組MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)31例（64.58%），Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)28例（58.33%）。觀察組的MMP-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 不同臨床特點(diǎn)膠質(zhì)瘤患者的MMP-2、Bax蛋白表達(dá)對(duì)比

不同性別、年齡、病灶位置、病灶直徑膠質(zhì)瘤患者的MMP-2蛋白陽(yáng)性率、Bax蛋白陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同病理分期膠質(zhì)瘤患者的MMP-2蛋白陽(yáng)性率、Bax蛋白陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ⅰ～Ⅱ期膠質(zhì)瘤患者的MMP-2蛋白陽(yáng)性率低于Ⅲ～Ⅳ期者，Bax蛋白陽(yáng)性率高于Ⅲ～Ⅳ期者（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 MMP-2、Bax表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性

通過(guò)Kaplan-Meier生存分析顯示，膠質(zhì)瘤患者中MMP-2陽(yáng)性者的中位生存期為16.9月（95%CI 13.6～24.2），MMP-2陰性者的中位生存期為21.5月（95%CI 20.2～25.3）。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，MMP-2陽(yáng)性者的中位生存期顯著低于陰性者（χ2=16.874，P=0.002）。膠質(zhì)瘤患者中，Bax陽(yáng)性者的中位生存期為21.3月（95%CI16.2～25.3），Bax陰性者的中位生存期為16.8月（95%CI13.6～21.1）。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，Bax陽(yáng)性者的中位生存期顯著高于陰性者（χ2=8.628，P=0.014）。

3 討論

膠質(zhì)瘤惡性程度高、呈侵襲性生長(zhǎng)是膠質(zhì)瘤的共同特點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤病理過(guò)程與MMPs家族表達(dá)異常存在密切聯(lián)系，MMPs能對(duì)腫瘤細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)造成破壞，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)缺失的細(xì)胞外基質(zhì)向周圍組織浸潤(rùn)，從而造成腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[3]。MMP-2不僅能對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中的明膠Ⅳ型膠原發(fā)揮降解作用，還能通過(guò)新生毛細(xì)血管促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，是惡性膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)、侵襲的重要標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中的MMP-2表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于正常腦組織，這與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4]結(jié)論相符。提示MMP-2可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。陳亮等[5]的研究顯示，具有侵襲性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞能分泌大量的MMP-2，膠質(zhì)瘤的侵襲能力、惡性程度均與MMP-2表達(dá)量呈正相關(guān)。本研究也顯示，Ⅲ～Ⅳ期膠質(zhì)瘤患者的MMP-2陽(yáng)性率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期者，這與前述研究結(jié)論基本一致。有學(xué)者[6]使用siRNA干擾MMP-2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)降低后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱，提示MMP-2可對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮促進(jìn)作用，同時(shí)MMP-2表達(dá)的高低與膠質(zhì)瘤侵襲能力的強(qiáng)弱密切相關(guān)，抑制MMP-2表達(dá)有助于降低膠質(zhì)瘤的侵襲程度。

已有多項(xiàng)研究證實(shí)[7,8]，檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)可為腫瘤診斷及預(yù)后評(píng)估提供有效依據(jù)。Bcl-2家族蛋白在多數(shù)細(xì)胞中都發(fā)揮著調(diào)控Caspase活化與凋亡的重要作用。Bax是Bcl-2家族最重要的促凋亡因子。Bax蛋白移位到線粒體中時(shí)，與線粒體膜上的Bcl-2蛋白結(jié)合，形成Bax-Bcl-2異二聚體，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用[9]。游離Bax也能在線粒體膜上直接形成Bax-Bax同二聚體，改變細(xì)胞膜通透性，促使大量的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞漿中，激活下游Caspase-3，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。本研究顯示，腦膠質(zhì)瘤的Bax表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于正常腦組織，并且Ⅲ～Ⅳ期膠質(zhì)瘤患者的MMP-2陽(yáng)性率明顯比Ⅰ～Ⅱ期者更低。這一結(jié)果與于澤奇等[11]報(bào)道相符，說(shuō)明Bax表達(dá)量隨著膠質(zhì)瘤病理分期的加重而降低。這可能是因?yàn)锽ax高表達(dá)能發(fā)揮誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用，在Bax蛋白減少、缺失的情況下，細(xì)胞將出現(xiàn)凋亡抵抗效應(yīng)。

表1 不同臨床特點(diǎn)膠質(zhì)瘤患者的MMP-2、Bax蛋白表達(dá)對(duì)比[例(%)]

王力夫等[12]報(bào)道顯示，MMP-2表達(dá)陽(yáng)性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，其死亡率是陰性者的2.75倍。本研究通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)膠質(zhì)瘤MMP-2陽(yáng)性者的中位生存期顯著低于陰性者，而Bax陽(yáng)性者的中位生存期顯著高于陰性者，這與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12]結(jié)論相符，說(shuō)明MMP-2、Bax均是膠質(zhì)瘤術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，MMP-2高表達(dá)、Bax低表達(dá)往往預(yù)示著不良預(yù)后，其可作為膠質(zhì)瘤術(shù)后患者預(yù)后預(yù)測(cè)的有效指標(biāo)，同時(shí)也可作為膠質(zhì)瘤術(shù)后患者的潛在治療靶點(diǎn)[13]。

綜上所述，老年膠質(zhì)瘤術(shù)后患者有MMP-2表達(dá)升高、Bax表達(dá)降低的特征，MMP-2表達(dá)陽(yáng)性、Bax表達(dá)陰性預(yù)示著不良預(yù)后。