姚鵬飛，杜情情，楊洪林，張 勇 （. 廣東華醫(yī)大司法鑒定中心，廣東廣州 5040； . 河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050000）

1 案例

1.1 案情簡(jiǎn)介

因需修改出生醫(yī)學(xué)證明，劉某委托我中心鑒定何某(孩子)與劉某(疑父)、陳某(生母)是否具有親子關(guān)系。本中心工作人員采集3位被鑒定人的指尖血至FTA血卡備檢。

1.2 DNA檢驗(yàn)

采用Chelex-100法提取樣本DNA，分別采用Microreader? 21 Direct ID System(閱 微 基 因 )、Microreader? 23sp ID System(閱微基因)試劑盒對(duì)常染色體上39個(gè)STR基因座進(jìn)行復(fù)核擴(kuò)增，并用PowerPlex?21(普洛麥格)試劑盒對(duì)常染色體上的19個(gè)STR基因座進(jìn)行驗(yàn)證。本次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增儀采用AB9700(美國(guó)AB公司)，擴(kuò)增體系及步驟均按試劑說明書操作，擴(kuò)增產(chǎn)物均在AB3130XL(美國(guó)AB公司)分析儀上進(jìn)行電泳分離檢測(cè)，分析軟件為GeneMapper? ID-X 1.5。并使用ForenSeq? DNA Signature Prep試劑盒(Verogen)中的引物A進(jìn)行文庫制備，在MiSeq? FGx(illumina)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行DNA測(cè)序，最后使用ForenSeq UAS軟件(Verogen)分析數(shù)據(jù)，該部分實(shí)驗(yàn)由河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院完成。

1.3 結(jié)果分析

1.3.1 毛細(xì)管電泳結(jié)果 在用Microreader? 21 Direct ID System(閱微基因)試劑盒檢驗(yàn)常染色體上20個(gè)STR基因座發(fā)現(xiàn)除D18S51基因座外，劉某均能提供給何某必需的等位基因。在D18S51基因座(圖1)，陳某的基因型為“14,16”，何某的基因型為“14,20”，劉某的基因型為“17,23”，劉某不能提供給何某必需的等位基因20，不符合遺傳規(guī)律。采用PowerPlex?21(普洛麥格)試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在上述兩種試劑重合的19個(gè)基因座(包括D18S51基因座)均一致，且各基因座峰高、峰面積等方面都比較均衡。使用Microreader? 23sp ID System(閱微基因)試劑盒繼續(xù)檢測(cè)19個(gè)多態(tài)性STR基因座，發(fā)現(xiàn)3名被鑒定人員在上述基因座上均符合遺傳規(guī)律。

1.3.2 二代測(cè)序結(jié)果 ForenSeq? DNA Signature Prep試劑盒的引物A包含一個(gè)性別基因座，27個(gè)常染色體STR，7個(gè)X-STR，24個(gè)Y-STR以及94個(gè)個(gè)體識(shí)別SNP。除D18S51基因座外，26個(gè)常染色體STR、7個(gè)X-STR、24個(gè)Y-STR和94個(gè)個(gè)體識(shí)別SNP在該案例中均符合孟德爾遺傳規(guī)律。在D18S51基因座，陳某的重復(fù)序列表現(xiàn)為：[AGAA]14AAAGAGAGAG、[AGAA]16AAAGAGAGAG，何某的重復(fù)序列表現(xiàn)為：[AGAA]14AAAGAGAGAG、[AGAA]20AAAGA GAGAG，劉某的重復(fù)序列表現(xiàn)為：[AGAA]17AAA GAGAGAG、[AGAA]23AAAGAGAGAG，檢測(cè)結(jié)果與STR分型結(jié)果一致。

圖1 D18S51基因座分型圖譜

2 討論

現(xiàn)有資料表明，STR突變是DNA復(fù)制滑動(dòng)的結(jié)果，STR突變是符合逐步突變模式的，即每次突變只改變一個(gè)重復(fù)單位，兩個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單位的變化是在前一次突變基礎(chǔ)上發(fā)生的，也就是多步突變是逐步形成的。STR等位基因的突變，絕大多數(shù)是重復(fù)單位數(shù)目的改變，每個(gè)突變都是增加或減少一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位。90%以上的STR突變均為增加或減少一個(gè)重復(fù)單位，即一步突變。二步突變者少于10%，更多步突變的比例更少[1]。

在本文的案例中，D18S51基因座的突變步數(shù)達(dá)到了三步，是非常罕見的情形，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)已有相關(guān)案例報(bào)道[2-3]。在親子鑒定過程中，當(dāng)父母至少一方和孩子為純合子，且峰高不正?；蛘咄蛔儾綌?shù)多的案例需注意是否存在等位基因丟失的可能，可采用另一套檢測(cè)系統(tǒng)加以驗(yàn)證[4]。有條件也可增加檢測(cè)高通量二代測(cè)序，以排除引物結(jié)合點(diǎn)變異或其它原因?qū)е碌哪繕?biāo)等位基因擴(kuò)增失敗。本文案例中，在D18S51基因座上父子母三者基因型均為雜合子，峰高均衡，采用兩種不同試劑盒及二代測(cè)序檢測(cè)得到一致結(jié)果，可判斷在D18S51基因座為不符合遺傳規(guī)律的基因座，考慮存在突變的可能性，按照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》(GB/T 37223-2018)中不符合遺傳規(guī)律情形時(shí)親權(quán)指數(shù)的計(jì)算方法，D18S51基因座的親權(quán)指數(shù)為0.0003。綜上39個(gè)STR基因座的累積親權(quán)指數(shù)(CPI)為4.1451× 1018，且在二代測(cè)序的94個(gè)SNP位點(diǎn)上，三者分型均符合遺傳規(guī)律。聯(lián)合可判定本案中D18S51基因座上不符合遺傳規(guī)律的現(xiàn)象為三步突變，且支持參與鑒定的三者間存在親子關(guān)系。

作為目前親子鑒定中常用的遺傳標(biāo)記 STR突變率在 0～7×10-3之 間，平均約 2×10-3。目前一般案件的檢測(cè)位點(diǎn)基本在20個(gè)左右，有些特殊案例甚至?xí)z測(cè)到40～50個(gè)位點(diǎn)，所以突變案件比例就顯得較高了，多步突變案件也時(shí)有發(fā)生。任何情況都不能僅憑一個(gè)遺傳標(biāo)記不符合遺傳規(guī)律就做出排除親權(quán)關(guān)系的意見，遇見疑似突變情況，建議可采用不同廠家的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)疑似突變位點(diǎn)加以驗(yàn)證，以排除等位基因丟失等情況，也可增加檢測(cè)遺傳標(biāo)記或檢測(cè)X-STR、Y-STR位點(diǎn)或采用二代測(cè)序技術(shù)來加強(qiáng)證據(jù)強(qiáng)度，綜合判定得到鑒定結(jié)果，這樣才能給客戶提供科學(xué)、專業(yè)的意見。