施辰, 曹海霞, 婁芮, 徐陳欣, 馮繼鋒

1 LncRNA概述

70%的人類基因組能夠被轉錄,但只有不到2%的轉錄產物具有編碼蛋白質的功能,其余的98%均為非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA),根據(jù)核苷酸序列的長度,ncRNA可分為短鏈ncRNA(short/small ncRNA)和長鏈ncRNA(long ncRNA,LncRNA),二者之間并沒有特別嚴格的界限,僅以ncRNA核苷酸序列的長度來區(qū)分,一般將長度大于200個核苷酸的ncRNA定義為LncRNA[1]。LncRNA分布廣泛,在動物、植物、酵母甚至病毒中均發(fā)現(xiàn)有LncRNA存在,其功能幾乎涉及到生物體生理及病理的全部生物學過程,既能調節(jié)細胞的增殖、分化及代謝等生理過程,也參與調節(jié)機體的各種病理過程,如癌癥、糖尿病、免疫病、阿爾茨海默病等[2]。盡管在過去20多年里,也有關于LncRNA的一些報道,但高通量測序技術的發(fā)展才使得從基因水平研究LncRNA成為可能[3]。為了更深入地開展LncRNA的相關研究,了解其功能及作用機制,科學家們根據(jù)LncRNA在基因組中所處的位置及背景,將其分為5種類型,即正義、反義、雙向、基因內及基因間LncRNA[4-5]。

目前關于LncRNA相關功能的研究中,最深入的便是其在癌癥中的作用。在正常的生理條件下,LncRNA的表達受到嚴格調控。相反,在許多癌癥的發(fā)生發(fā)展中均伴隨著LncRNA的異常表達,它們既可以作為原癌基因促進腫瘤的生成,亦可作為抑癌基因來抑制腫瘤細胞的增殖、遷移等[6]。因此,LncRNA可以成為癌癥的特異性標志物和治療靶點[7]。一項對膀胱癌患者組織進行芯片分析的研究結果發(fā)現(xiàn),有3 324個LncRNA發(fā)生了異常表達,且這些LncRNA表達與健康對照組相比,差異倍數(shù)≥2,其中有110個LncRNA表達差異非常明顯,與健康對照組相比,差異倍數(shù)≥8。進一步實驗證明,LncRNA TNXA、CTA.134P22.2、CTC.276P9.1及KRT19P3變化與芯片數(shù)據(jù)高度一致[8]。另一項研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19在膀胱癌組織中高表達,上調LncRNA H19可加速膀胱癌細胞的轉移,其機制可能是LncRNA H19通過與果蠅zeste基因增強子的人類同源物2(EZH2)結合后激活Wnt/β連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路,并下調鈣黏附蛋白(E-cadherin)的表達來促進膀胱癌的轉移[9]。除了膀胱癌,LncRNA H19在前列腺癌中還可以通過LncRNA H19-miR675軸調節(jié)轉化生長因子β誘導蛋白(TGFβI),從而抑制前列腺癌的轉移[10]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA AFAP1.AS1在食管腺癌及其癌前病變巴雷特食管中都呈高表達,而當小干擾RNA將LncRNA AFAP1.AS1沉默時,則能抑制食管腺癌細胞的分化、侵襲及轉移[11]?？傊?LncRNA是真核生物轉錄本中非常重要的組成部分,它在機體的生理及病理過程中均發(fā)揮著極其重要的作用。

2 鉑類藥物

鉑類藥物是一類非特異性細胞周期抗腫瘤藥物,目前在臨床治療中應用中較多的有順鉑、卡鉑、奧沙利鉑。這類藥物可以通過影響腫瘤細胞DNA的結構和功能發(fā)揮抗癌作用[12]。鉑類藥物進入細胞后先發(fā)生解離失去酸根負離子,再結合兩分子的水,形成帶正電荷的水合鉑。這個帶正電荷的水合鉑可以和細胞內的DNA、RNA和蛋白質結合。其中DNA嘌呤堿基上的N7位點又是鉑類抗腫瘤藥物的關鍵靶點,從而形成鏈內交聯(lián)、鏈間交聯(lián)和DNA-蛋白質分子間交聯(lián),其中又以鏈內配對交聯(lián)為主,所有的交聯(lián)都會使DNA鏈發(fā)生局部扭轉或解旋,進而造成DNA損傷,最終導致腫瘤細胞周期阻滯或細胞凋亡[13-14]。由于上述鉑類藥物與細胞內各組分的非特異性結合以及鉑類藥物損傷DNA、誘導凋亡機制的多樣性,使得腫瘤細胞對鉑類藥物的耐藥性可以經由多種途徑發(fā)生,腫瘤細胞的耐藥性也成為影響化療效果和腫瘤根治的主要障礙[15]。腫瘤耐藥分為原藥耐藥(primary drug resistance,PDR)和多藥耐藥(multidrug resistance,MDR),PDR指腫瘤細胞對已使用過的藥物產生了耐藥作用,而MDR指腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥后,又對其他不同作用機制的藥物也產生了耐藥,MDR可出現(xiàn)在多種惡性腫瘤疾病中,如卵巢癌、胃癌、大腸癌、肺癌等。而鉑類抗腫瘤藥物結構上的相似性使得耐藥性或交叉耐藥性成為限制其臨床應用的主要障礙之一[14]。鉑類藥物耐藥的途徑主要有4種:① 藥物跨膜轉運降低,使藥物在腫瘤細胞內的蓄積減少;② 細胞內谷胱甘肽(glutathione,GSH)和金屬硫蛋白(metallothionein,MT)濃度增加,使鉑類藥物代謝失活;③ DNA損傷修復功能增強,腫瘤細胞忽略鉑類藥物導致的DNA損傷而繼續(xù)增殖;④ 細胞凋亡功能受抑制,腫瘤細胞無法通過凋亡通路被殺滅[16-17]。

3 LncRNA參與腫瘤鉑類藥物耐藥的機制

腫瘤細胞對抗癌藥物產生耐藥性是化療失敗的主要原因之一。不管是先天性耐藥還是后天獲得性耐藥,細胞內信號通路的異常激活均與腫瘤耐藥性密切相關[18]。近年研究發(fā)現(xiàn),LncRNA可在染色體修飾、轉錄以及轉錄后水平方面廣泛地對基因的表達進行調控,并參與X染色體沉默、基因組印記、核內運輸和轉錄激活、轉錄干擾等調控過程,從而影響細胞的增殖、分化和凋亡,并導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲遷移等一系列活動[19]。LncRNA對腫瘤耐藥的相關作用機制較復雜,主要有以下幾類。

3.1 LncRNA通過調控信號通路引起細胞周期的改變造成耐藥 研究發(fā)現(xiàn),LncRNA可以通過影響腫瘤細胞周期造成耐藥[20]。比如在骨肉瘤組織中LncRNA HOTTIP明顯高于正常組織;用不同劑量的順鉑處理骨肉瘤細胞,HOTTIP高表達促進細胞進入S期,促使細胞對順鉑耐藥;其機制為HOTTIP通過激活Wnt/β-catenin途徑來增加骨肉瘤細胞對順鉑的耐藥性[21]。LncRNA HOTAIR是第1個發(fā)現(xiàn)的具有反式調節(jié)轉錄作用的LncRNA,其在多種惡性腫瘤中高表達。有研究發(fā)現(xiàn)與親本肺腺癌細胞系(A549)相比,HOTAIR在順鉑耐藥的肺腺癌細胞系(A549/DDP)中的表達顯著上調,因此HOTAIR可作為腫瘤轉移及預后的預測因子[13,22]。HOTAIR亦可通過激活Wnt/β-catenin信號通路使細胞對順鉑耐藥,而敲除HOTAIR則對Wnt/β-catenin信號通路產生抑制,使細胞周期停滯在G0期,細胞的增殖能力下降,使化療敏感性增強[22-23]。另一項研究報道指出LncRNA MEG3在順鉑耐藥的肺腺癌細胞系A549/DDP中的表達明顯下降,升高MEG3的表達可抑制肺腺癌細胞增殖,其機制也是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路引起腫瘤細胞發(fā)生周期阻滯,從而增加A549/DDP細胞對順鉑的敏感度,抑制腫瘤的進展[24]。

3.2 LncRNA參與調控腫瘤細胞凋亡 一些腫瘤化療藥物是通過誘導細胞凋亡而抑制腫瘤細胞的生長,所以凋亡調節(jié)失控也可引起耐藥的發(fā)生。LncRNA可以通過上調Bcl-2、核因子-κB(NF-κB)、凋亡抑制蛋白(IAP)等促生存因子獲得凋亡抗性,或者抑制半胱氨酸蛋白酶(caspase)、p53等抑癌基因表達產生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)復發(fā)性鉑類耐藥卵巢腫瘤的LncRNA HOTAIR表達水平高于原發(fā)性卵巢腫瘤,并且HOTAIR的上調可以誘導卵巢癌發(fā)生鉑類耐藥。其機制是HOTAIR使DNA損傷修復持續(xù)激活,促進NF-κB表達、白細胞介素-6(IL-6)分泌以及活化細胞周期檢測點激酶1(CHK1)-p532-p2途徑,從而抑制細胞凋亡,產生化療耐藥性。在DNA損傷修復期間,驅動NF-κB-HOTAIR軸正反饋環(huán)級聯(lián)有助于增加細胞凋亡和化療敏感性。順鉑耐藥卵巢癌細胞(SKOV-3/DDP、A2780/DDP)比順鉑敏感細胞(SKOV-3和A2780)的LncRNA PVT1過表達。已知PVT1與原癌基因MYC共同位于染色體8q24,兩者的表達與人類原發(fā)腫瘤的產生有關。PVT1過表達使轉化生長因子-β1(TGF-β1)、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白表達水平降低,腫瘤細胞凋亡比例減少,細胞活力升高造成耐藥,而敲低PVT1可以使TGF-β1、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高,腫瘤細胞凋亡比例增加,細胞活力降低,進而逆轉順鉑耐藥細胞株的順鉑耐藥性[25]。可見PVT1通過調節(jié)細胞凋亡途徑參與卵巢癌順鉑耐藥性的產生。此外在泌尿系統(tǒng)腫瘤研究中發(fā)現(xiàn),膀胱癌細胞中的LncRNA UCA1表達減少,會抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡,降低順鉑敏感性,而UCA1的過表達增加了膀胱癌細胞的化療敏感性,其機制是UCA1和環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)啟動子結合,激活miR-196a-5p表達,miR-196a-5p可以直接靶向p27kip1,誘導細胞凋亡,從而參與順鉑耐藥[26]。

3.3 LncRNA作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)發(fā)揮耐藥作用 近年來研究發(fā)現(xiàn),LncRNA能以“海綿”吸附方式與miRNA競爭性結合并調節(jié)細胞的生物學行為,因此此類LncRNA被稱為ceRNA,在腫瘤的藥物敏感性中發(fā)揮重要的作用[20,27]。LncRNA UCA1可以通過競爭性結合miR-204-5p調控靶基因CREBl/BC12/RAB22A,從而介導MDR[28]。另外在順鉑敏感的骨肉瘤細胞中,LINC00161通過競爭性結合和上調四肽重復的干擾素誘導蛋白(IFIT2)表達,促進細胞凋亡,增強化療敏感性,而LINC00161在順鉑耐藥細胞中表達下調,則使骨肉瘤細胞產生順鉑耐藥性[29]。

3.4 LncRNA通過調節(jié)耐藥相關基因及蛋白參與腫瘤細胞耐藥 多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene1,MDR1)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance related proteins,MRP)參與了多種腫瘤的鉑類耐藥[30]。LncRNA可以通過靶向調節(jié)這些耐藥相關基因參與腫瘤對鉑類藥物的耐藥機制。據(jù)文獻報道INK4基因座的反義LncRNA ANRIL在順鉑耐藥的胃癌細胞(BGC823/DDP)中表達升高,且ANRIL的表達與MRP的表達呈正相關,通過敲低ANRIL可以抑制MDR1和MRP1的表達,從而抑制胃癌耐藥性的進展[31]。此外研究發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1在對順鉑耐藥的胃癌組織和耐藥細胞系中呈高表達,敲除PVT1可逆轉胃癌細胞對順鉑的耐藥性,qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示,PVT1表達的上調可以促進MDR1的表達,從而導致胃癌細胞對化療耐藥的發(fā)生[32]。

3.5 LncRNA通過影響藥物轉運體系干擾藥物代謝

藥物外排系統(tǒng)的改變是腫瘤耐藥機制中最常見的一種。由于藥物流出的增加,導致細胞內藥物濃度低于細胞殺傷閾值從而引起腫瘤耐藥。ATP結合盒超家族成員(ATP-binding cassette,ABC)是影響化療藥物敏感性的重要藥物轉運體,這些蛋白通過利用ATP水解的能量將細胞內的藥物泵出到細胞外,從而降低細胞內藥物的濃度使細胞產生耐藥性,尤其對于MDR的影響極為突出[33]。而LncRNA可以通過調節(jié)ABC超家族蛋白的表達從而調控腫瘤化療耐藥。例如LncRNA MRUL是與胃癌MDR相關的一種LncRNA,有報道指出MRUL可以調節(jié)ABC家族中的細胞膜P-糖蛋白(P-gp)表達從而發(fā)揮增強子樣的作用,其可促進P-pg的表達導致相關化療藥物外排增多、攝入減少,從而促進MDR形成,而抑制MRUL可提高化療藥物的敏感性[34]。

3.6 LncRNA可以調節(jié)上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) EMT是指與基底膜相連的上皮細胞喪失細胞極性和細胞-細胞間黏附能力,成為間充質細胞,這種生物學性狀的改變使細胞獲得遷移和侵襲能力[35]。多種腫瘤細胞經過化療后會發(fā)生EMT,這種適應性變化的產生使腫瘤細胞發(fā)生繼發(fā)性耐藥。近年來腫瘤干細胞被認為是對藥物高度耐藥的一類細胞,且EMT與腫瘤干細胞的生物學表型有著密切聯(lián)系[36-37]。LncRNA UCA1位于人類染色體19p13.12,總長1439 bp,包含3個外顯子,UCA1可通過調節(jié)EMT影響腫瘤細胞對鉑類化療藥物的敏感度[38]。又有研究指出HOTAIR可以誘導肺癌細胞發(fā)生EMT,其機制是HOTAIR可以促進EZH2過表達來抑制SCLC細胞中與EMT相關的基因表達[39]。又如在腎細胞癌中HOTAIR是組蛋白脫甲基酶JMJD3的正向調節(jié)因子,其可以促進靶基因Snail上調,而Snail能促進EMT,所以HOTAIR也可以通過組蛋白修飾來介導EMT[40]。

4 小結與展望

多種LncRNA在化療敏感性和耐藥性細胞中的表達不同,它們通過調節(jié)基因表達直接或間接影響化療效果,其引起的鉑類藥物耐藥過程往往不止一種機制被激活,抑制單一的耐藥信號通路往往不能使化療效果恢復到正常水平,因此克服鉑類藥物的耐藥性可能需要同時針對多種耐藥機制才能起作用。LncRNA在癌癥中的特異性表達使其可以作為癌癥診斷和預后的標志物以及新的治療靶點,給未來的腫瘤治療帶來了新希望。