黃 倞，王 元，馬清揚，英 娜，趙 姝，吳 越，房文紅

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）對鹽度適應(yīng)能力強，不僅可以在海水中養(yǎng)殖，經(jīng)淡化后也可以在淡水中養(yǎng)殖［1］，2017年我國淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦產(chǎn)量達到59.1萬 t，占其養(yǎng)殖總產(chǎn)量35.5%。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，病害成為制約凡納濱對蝦養(yǎng)殖的重要因素之一，其中由副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）引起的急性肝胰腺壞死癥，給對蝦養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失［2］。副溶血弧菌是一種廣泛存在于海水、半咸水環(huán)境中的革蘭氏陰性嗜鹽菌，不僅感染魚蝦貝等水生動物［3］，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成極大損失，而且也是重要的食源性病原菌，可導(dǎo)致腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎［4］。副溶血弧菌可產(chǎn)生耐熱性直接溶血素（TDH）、TDH相關(guān)溶血素（TRH）和不耐熱性溶血素（TLH）3種重要溶血素，其在感染致病過程中發(fā)揮重要作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）和Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）是與副溶血弧菌致病性密切相關(guān)的毒力因子［6-7］。T3SS主要由蛋白復(fù)合物形成跨膜分泌管道，似針狀結(jié)構(gòu)刺入宿主細胞將效應(yīng)蛋白直接注入細胞質(zhì)中，發(fā)揮細胞毒性［7］。副溶血弧菌兩條染色體上各有一套T3SS系統(tǒng)，在染色體Ⅰ上的命名為T3SS1，在染色體Ⅱ上的命名為T3SS2。T3SS1系統(tǒng)由結(jié)構(gòu)蛋白 （如 VscA1-VscY1、VcrD1、VcrG1、VcrR1、VcrV1）和效應(yīng)蛋白 （VopQ、VopR、VopS和VPA0450等）構(gòu)成，主要發(fā)揮對宿主細胞的細胞毒性、介導(dǎo)宿主細胞自噬凋亡等作用［8-9］。T3SS2在染色體II的毒力島上，由類似T3SS1的結(jié)構(gòu)蛋白和7個效應(yīng)蛋白（VopA／P、VopL、VopC、VopT、VopV、VopZ和VPA1380）構(gòu)成，主要引起細菌腸毒性和一定的細胞毒性［10-11］、致病性副溶血弧菌不僅出現(xiàn)在海水養(yǎng)殖動物中，在淡水養(yǎng)殖的凡納濱對蝦也有檢出［12］，但針對不同鹽度環(huán)境中的副溶血弧菌毒力的研究鮮有報道。本研究選取了2株不同鹽度養(yǎng)殖環(huán)境中分離的副溶血弧菌，比較2株副溶血弧菌在不同鹽度下的致病性、毒力基因攜帶情況，探索了鹽度對它們的毒力基因表達的影響，以期為不同鹽度下副溶血弧菌毒力機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗用副溶血弧菌海水菌株383分離自海南瓊海海水養(yǎng)殖發(fā)病凡納濱對蝦，淡水菌株V9分離自上海奉賢淡水養(yǎng)殖發(fā)病凡納濱對蝦，鑒定后保藏于本實驗室。細菌分離采用TCBS選擇性培養(yǎng)基，采用gyrB［13］和 16SrDNA［13］基因?qū)Ψ蛛x細菌進行分子鑒定，生化鑒定結(jié)果參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。

1.2 實驗試劑

TCBS培養(yǎng)基購自青島海博公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；細菌DNA和RNA提取試劑盒分別購自上海生工生物工程股份有限公司和天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司；非發(fā)酵G-桿菌鑒定試劑盒購自梅里埃公司。基因測序由上海瑞迪生物公司完成。

LB液體培養(yǎng)基配方：稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，加純水定容至1 L，氯化鈉隨鹽度變化計算添加量。

1.3 不同鹽度下弧菌生長速率實驗

從TCBS平板挑取菌落，用無菌生理鹽水制成菌懸液。移取菌懸液分別接入液體培養(yǎng)基，使2株弧菌懸濁度相近，液體培養(yǎng)基鹽度分別為2、10、20、30、40、50、60、70和80，設(shè)2個平行。于 28℃、轉(zhuǎn)速 180 r·min-1下培養(yǎng)。取 0、4、12、24、48 h的菌液在酶標儀（Spark 10 m，Tecan）上測定OD600時的吸光值。

1.4 弧菌感染實驗

實驗在東海所實驗基地進行，感染用凡納濱對蝦為實驗基地養(yǎng)殖，體長5～7 cm，體質(zhì)量4～5 g。實驗在30 L塑料桶里進行，每個桶放養(yǎng)對蝦10尾，海水鹽度22，水溫控制在24～26℃，充氣增氧，投喂適量顆粒飼料，經(jīng)3 d適應(yīng)養(yǎng)殖后用于感染實驗。

菌株383和菌株V9分別接種于鹽度25和2的液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)16 h，配置5個細菌攻毒濃度梯度，采用肌肉注射方式進行攻毒，注射量50μL·尾-1，對照組注射生理鹽水和煮沸滅活的菌體。攻毒組與對照組各設(shè)置2個平行組，每天記錄死亡量，連續(xù)觀察4 d。半致死濃度計算采用 Bliss法［34］。

1.5 弧菌毒力基因檢測

采用 PCR（Mastercycler pro，Eppendorf）對 2株副溶血弧菌的毒力基因進行檢測。檢測的毒力 基 因 有tdh［14］、trh［14］、tlh［15］、T3SS1［16］、T3SS2［16］、pirA［17］、pirB［17］、orf8［18］、toxR／S［19］，其方法和引物參照相應(yīng)毒力基因的文獻，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

采用熒光定量 PCR（QuantStudio，ABI）檢測vcrD1［20］、vopS［20］、vopD1［20］和pirA［17］基因 表 達量，內(nèi)參基因為pvuA［21］，定量PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.6 鹽度對副溶血弧菌T3SS1毒力基因表達的影響

1.6.1 弧菌培養(yǎng)

將2株副溶血弧菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的細菌以1%的比例分別接種于鹽度2、10、20和30的LB液體培養(yǎng)基，于180 r·min-1搖床培養(yǎng)。根據(jù)生長曲線估計培養(yǎng)時間，在OD600達到0.6時，取菌液4℃離心取沉淀。每個試驗組各設(shè)2個平行。

1.6.2 總 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

總RNA提?。菏褂肨IANGEN細菌RNA提取試劑盒提取副溶血弧菌總RNA，操作在紫外線滅菌的獨立RNA實驗室中進行。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，同時用微量紫外分光光度計（ND5000，百泰克）測定RNA濃度。

反轉(zhuǎn)錄：采用DNA水解酶去除總RNA中殘留的DNA；采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA分裝后置于-80℃保存。

1.6.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系與條件

反應(yīng)體系為10μL，其中cDNA 2μL，2×TB Green Premix ExTaqⅡ 5μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.2μL，10μmol·L-1上下游引物各0.4μL，無菌雙蒸水 3μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min，預(yù)變性：95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，72℃實時檢測熒光信號，同時進行ROX值校正。最后進行RT-PCR溶解曲線分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對兩株副溶血弧菌生長速率的影響

分析2株弧菌在不同鹽度培養(yǎng)基下的生長速率（圖1），可以看出：海水菌株383在低鹽度下（培養(yǎng)基鹽度≤30時）生長速率快，培養(yǎng)12 h即接近生長穩(wěn)定期；高鹽度（鹽度＞30）時，其生長速率下降，24～48 h達到生長穩(wěn)定期。淡水菌株V9除鹽度80外，在其他鹽度下都是在24 h達到生長穩(wěn)定期。海水菌株383可以在鹽度高達80的培養(yǎng)基中生長，而淡水菌株V9在此鹽度下幾乎不生長；2株弧菌生長達到生長穩(wěn)定期時，淡水菌株V9濃度明顯高于海水菌株383。

2.2 弧菌回感實驗結(jié)果

感染發(fā)病的凡納濱對蝦肝胰腺顏色變淡呈淺白色，萎縮變小，邊緣模糊。2株副溶血弧菌感染凡納濱對蝦48 h死亡情況見圖2，經(jīng)計算，海水菌株383和淡水菌株V9的48 h半致死濃度（LD50）分別為1.73×103cfu·mL-1和1.32×105cfu·mL-1，由此可見海水菌株383的毒力明顯高于淡水菌株V9。在本實驗中，注射滅活菌液和生理鹽水對照組未見對蝦死亡。

圖1 副溶血弧菌在不同鹽度下生長速率（n=2）Fig.1 Growth rate of Vibrio parahaemolyticus at different salinities

圖2 副溶血弧菌肌肉注射感染凡納濱對蝦48 h死亡率（n=2）Fig.2 48 h mortality rate of Litopenaeus vannamei infected by Vibrio parahaemolyticus after intramuscular injection

2.3 弧菌毒力基因攜帶情況

采用PCR方法對2株副溶血弧菌分別進行tlh、tdh、trh、T3SS1、T3SS2、pirA、pirB、toxR／S、orf8基因檢測，檢測結(jié)果見表1。2株副溶血弧菌tlh、T3SS1、pirA和pirB為陽性，tdh、trh、T3SS2、toxR／S和orf8為陰性。

2.4 鹽度對2株弧菌毒力基因表達的影響

對檢測結(jié)果為陽性的T3SS1基因和pirA基因進行鹽度影響的基因表達分析。

不同鹽度對2株副溶血弧菌4個毒力基因表達的影響見圖3。從4個毒力基因來看，vcrD1表達量較高，其次是pirA，vopD1表達量最低。進一步分析，不同菌株以及鹽度對毒力基因表達有較大的影響。海水菌株383的pirA在不同鹽度均有表達，在鹽度20時表達量最高；而淡水菌株V9的pirA僅在鹽度2時有表達，其表達量分別為菌株383在鹽度2和鹽度20下的54.7%和9.3%。2株菌株vopD1基因在不同鹽度下都有表達，均在鹽度2時表達量最高。淡水菌株V9的vopS基因在不同鹽度都有表達，而海水菌株383在鹽度10、20和30有表達，其表達量均低于淡水菌株。在鹽度20時海水菌株383的vcrD1基因超高表達，是其他鹽度的8.5～17.5倍；淡水菌株V9在鹽度2時有表達，在其他鹽度下表達量較低。從2個菌株來看，差別最大的毒力基因是pirA和vcrD1。

表1 2株副溶血弧菌毒力基因檢測結(jié)果Tab.1 Detection results of virulence genes of two strains of Vibrio parahaemolyticus

圖3 不同鹽度下2株副溶血弧菌毒力基因表達量（n=2）Fig.3 Expression of several virulence genes in Vibrio parahaemolyticus at different salinities

3 討論

3.1 淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦為副溶血弧菌進入淡水環(huán)境帶來風險

副溶血弧菌為嗜鹽菌，多出現(xiàn)在海水和半咸水環(huán)境，在淡水及淡水產(chǎn)品中檢出率較低［12］。為了提高淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦成活率，在蝦苗放養(yǎng)前往往向淡水中添加海水鹽提高水的鹽度，因此部分弧菌能得以生存且存在致病性［23］。本研究中的淡水菌株正是從該養(yǎng)殖方式下的一例病蝦內(nèi)分離獲得的病原菌。從本研究結(jié)果來看，淡水菌株適應(yīng)了低鹽度環(huán)境后在低鹽度下生長速率快于海水菌株，同時對高鹽度的耐受力有所下降。由此可見，淡水中養(yǎng)殖對蝦為副溶血弧菌侵入淡水養(yǎng)殖品種提供了輸入途徑，咸化的淡水為副溶血弧菌提供了生存條件。淡水養(yǎng)殖海水對蝦，可以導(dǎo)致病原向新的水體輸入，應(yīng)引起一定的重視。

3.2 鹽度影響副溶血弧菌毒力基因的表達

環(huán)境因素如溫度、鹽度、酸堿度等都會影響毒力基因的表達，且不同的環(huán)境條件對不同毒力基因表達的影響是不一致的［20，23-24］?；【菞l件致病菌，在外界環(huán)境條件穩(wěn)定時一般不會引起發(fā)病，但一些環(huán)境因子的改變，例如溫度、鹽度等均可以調(diào)控其致病性相關(guān)蛋白的表達，從而影響細菌的致病性［23-25］。溶藻弧菌（V.alginolyticus）在溫度28℃、鹽度20、培養(yǎng)基初始pH為7時，其T3SS轉(zhuǎn)運蛋白VscO基因表達量最高［25］。遲緩愛德華菌在25℃時分泌的EvpA、EvpC、EseB和EseD蛋白明顯多于37℃時；注射感染37℃培養(yǎng)的遲緩愛德華菌，90%的線足鱸（Trichogaster trichopterus）成活，而注射25℃培養(yǎng)的遲緩愛德華菌，則有70%線足鱸死亡［26］。雖然該菌在37℃條件下生長快，但其T3SS輸送器蛋白表達較低；在28℃條件下T3SS輸送器蛋白表達最高，而在20℃條件下則沒有檢測到T3SS輸送器蛋白的表達。同等溫度下，中性和堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更適合細菌生長和T3SS輸送器蛋白的表達［27］。本研究中，鹽度對副溶血弧菌pirA基因和T3SS1內(nèi)膜蛋白vcrD1基因表達有較大的影響，不僅存在菌株間的差異，而且同一菌株的不同毒力基因受到的影響也是不同的。鹽度對副溶血弧菌毒力基因表達的影響機制還有待進一步研究，以為揭示副溶血弧菌致病機制提供理論依據(jù)。

3.3 副溶血弧菌海水菌株和淡水菌株的毒力分析

pirA和pirB最早是在副溶血弧菌中發(fā)現(xiàn)的、由質(zhì)粒介導(dǎo)的重要毒力因子［28］，由其引起的急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）對全球的對蝦產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失［28］。患病對蝦肝胰腺顏色變淡呈淡白色，部分患病對蝦肝胰腺明顯萎縮，質(zhì)地變硬，腸胃變空。2018年有報道，pirA和pirB毒力基因出現(xiàn)在多種弧菌中，均能引起對蝦AHPND［29］。

T3SS作為副溶血弧菌的主要毒力因子之一，通過傳遞與致病有關(guān)的毒性因子來發(fā)揮病原菌的毒性，而鹽度是影響細菌基因表達以及其他生命活動的關(guān)鍵生態(tài)因子。副溶血弧菌T3SS1主要是對宿主細胞產(chǎn)生細胞毒性，介導(dǎo)宿主細胞的自體吞噬作用，最后導(dǎo)致細胞死亡。T3SS1在感染過程中與宿主細胞的凋亡有關(guān)，對多種細胞系如 HeLa細胞、Raw細胞均具有細胞毒性［1，30］。T3SS2又分為T3SS2α和T3SS2β兩種，且兩者不能存在于同一株菌中［31］；T3SS2β僅存在于 KP＋分離株中，與兔回腸袢結(jié)扎實驗?zāi)Ｐ椭械哪c毒性有關(guān)［32］。本文2株副溶血弧菌只檢測到T3SS1，未能檢測到T3SS2。

vcrD1編碼的內(nèi)膜蛋白是組成T3SS1分泌裝置基體的一部分，在此基礎(chǔ)上針管狀結(jié)構(gòu)蛋白才能繼續(xù)生長。vopD1編碼的轉(zhuǎn)運蛋白能在宿主細胞膜表面形成孔洞，效應(yīng)蛋白沿該通道進入宿主細胞，具有HeLa細胞毒性和接觸溶血活性，轉(zhuǎn)運蛋白vopD1高表達有利于T3SS分泌通道的完善，釋放分泌蛋白，表現(xiàn)細菌毒性［33］。vopS編碼的效應(yīng)蛋白可導(dǎo)致細胞變圓并通過抑制RhoB家族的鳥苷三磷酸酶導(dǎo)致肌動蛋白細胞骨架崩潰，并且vopS可以阻止Rho家族的鳥苷三磷酸酶與下游的效應(yīng)蛋白反應(yīng)，抑制感染細胞內(nèi)肌動蛋白的重排［34］。

比較分析本研究中2菌株的毒力與pirA、T3SS1效應(yīng)蛋白基因表達量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩株菌的pirA和vcrD1表達量相差10倍左右，結(jié)合半致死濃度（LD50），兩菌株的LD50相差近2個數(shù)量級。因此認為，2株副溶血弧菌的毒力強弱可能與pirA和vcrD1的表達量有關(guān)。