楊 穎,田文沁

(北京大學人民醫(yī)院 輸血科，北京100044)

血小板是血液循環(huán)中體積較小的無核細胞，由骨髓中的巨核細胞產生，其在止血和血栓形成的過程中發(fā)揮了重要的作用[1]。當血管發(fā)生損傷時，血小板能夠黏附于受損的血管內皮，并形成血栓，進而發(fā)揮止血的作用[2]。然而，血小板的過度活化可以導致血栓性疾病的發(fā)生[3]。血小板在活化的過程中會發(fā)生細胞骨架的重排，進而引起其形態(tài)變化、顆粒分泌以及聚集等一系列改變。骨架相關分子參與調控血小板細胞骨架重排，這其中就包括Rho蛋白[4]。本文擬對Rho蛋白調控血小板細胞骨架重排的分子機制研究進展進行綜述。

1 Rho蛋白的概述

Rho蛋白是一組相對分子質量為20-25 kD的三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)結合蛋白，因其具有GTP酶活性，又被稱為Rho GTP酶，Rho GTP酶在調控細胞骨架重排方面發(fā)揮重要的作用。已知的Rho蛋白家族有20余個成員，根據(jù)其結構和功能不同，可分為Rho亞家族、Rac亞家族、Cdc42亞家族、Rnd亞家族、Rho BTB亞家族等[5,6]。其中，Cdc42、Rac1和RhoA是目前研究最多的Rho蛋白。Rho蛋白是一種開關蛋白，包括無活性的GDP結合的形式以及有活性的GTP結合的形式，這二者之間在Rho蛋白調控分子的調控下可以相互轉換[7]。活化的Rho蛋白即GTP結合的Rho蛋白可以與下游的效應分子結合，發(fā)揮調控細胞骨架重排、細胞遷移運動等作用[8]。研究表明，Rho蛋白家族的Cdc42、Rac1和RhoA在血小板中均有表達，它們在血小板收縮、偽足形成以及顆粒分泌等發(fā)面發(fā)揮了重要的調控作用[9-11]。

2 Rho蛋白在血小板中的調控作用

2.1 RhoA調控血小板收縮并維持血栓穩(wěn)定性

當血小板激活劑如凝血酶、血栓烷類似物等與血小板表面膜受體結合后，可以使血小板活化?；罨难“迤淠な荏w可以發(fā)生一系列分子結構的改變，其中Gα13亞基可以激活p115RhoGEF，進而使RhoA活化?；罨腞hoA可以激活其下游效應分子Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK)，活化的ROCK可以增強肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)的磷酸化水平，進而促進肌球蛋白收縮[12]。同時，活化的RhoA 還可以激活另一個重要的下游效應分子mDia(Mammalian Diaphanous related protein，mDia)，活化的mDia分子可以促進肌動蛋白絲的延伸和成核，進而在血小板內形成新的應力纖維，促進血小板的收縮和遷移運動[13]。

整合素受體在RhoA對血小板的調控過程中也發(fā)揮了重要的作用。血小板活化后，Gα13亞基在激活RhoA的同時，可以與血小板膜表面的整合素受體αⅡbβ3的胞內段β3亞基結合，進而促進Src激酶的活化，活化的Src激酶可以激活p190RhoGAP，從而使GTP水解，導致RhoA失活。隨后，血小板胞內的鈣信號通路被激活，鈣調蛋白可以將整合素受體αⅡbβ3的胞內段的β3亞基剪切掉，從而抑制Src激酶的活性，使失活的RhoA恢復活性形式[14]。RhoA的這一變化過程，在促進血小板的收縮、促進血塊的彈性回縮以及維持血栓穩(wěn)定性的過程中發(fā)揮了重要的作用。研究表明，RhoA缺陷的小鼠，其血小板的收縮能力減弱、血栓形成能力減弱以及鼠尾出血時間延長[11,15]。

2.2 Cdc42促進血小板絲狀偽足的形成并調控其顆粒分泌

Cdc42高表達于血小板中，當凝血酶、ADP等激活劑使血小板活化后，Cdc42聚集于血小板細胞骨架區(qū)域，通過與下游效應分子結合，促進血小板表面絲狀偽足的形成并參與調控血小板的顆粒分泌。絲狀偽足有助于血小板確定細胞遷移的方向，顆粒分泌可以促進血小板聚集[16,17]。在真核細胞中，活化的Cdc42激活Wiskott Aldrich綜合征蛋白家族(Wiskott Aldrich syndrome protein，WASP)，進而激活肌動蛋白相關(actin related protein 2/3，Arp2/3)復合體，促進肌動蛋白單體組裝成肌動蛋白絲，進而促進絲狀偽足的形成[6]。然而，有研究表明，將Cdc42條件性敲除或者在體系中加入Cdc42的抑制劑，細胞同樣可以形成絲狀偽足。這也提示了，體系中可能存在與Cdc42功能類似的其他Rho蛋白[18,19]。在血小板中Cdc42調控絲狀偽足形成的機制也并不是完全清楚，但是研究表明，Cdc42缺陷的血小板，其絲狀偽足的形成能力減弱，血小板顆粒分泌異常，這也證明了Cdc42在調控血小板功能方面發(fā)揮了重要的最用[16]。

2.3 Rac1促進血小板板狀偽足的形成

Rac亞家族包括Rac1、Rac2和Rac3三個成員，其中Rac1和Rac2表達于血小板中，Rac1在血小板中發(fā)揮了重要的調控作用，Rac2在血小板中的作用并不清楚[20]。與Cdc42類似，當凝血酶、膠原等激活劑使血小板活化后，Rac1也聚集于血小板細胞骨架區(qū)域，誘導血小板表面質膜突起，形成板狀偽足。板狀偽足可以促進血小板與周圍基質形成粘附連接，并形成遷移運動時的錨定位點。在血小板中，活化的Rac1激動其下游效應分子WASP家族富含脯氨酸同源蛋白(WASP family verprolin homologous protein，WAVE)，隨后激活Arp2/3復合體，促進肌動蛋白絲的形成，進而在血小板膜表面形成肌動蛋白絲豐富的板狀偽足[21]。研究表明，Rac1缺陷的血小板，其板狀偽足的形成能力減弱，血小板聚集能力減弱[10]。

3 Rho蛋白的調控分子在血小板中的作用

如前所述，Rho蛋白是一種開關蛋白，活化的Rho蛋白和非活化的Rho蛋白可以在鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchanging factors，GEFs)、GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)和GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)等分子的調控下相互轉換[22]。

3.1 GEFs對血小板中Rho蛋白的正向調控作用

GEFs催化Rho蛋白的GDP的釋放，促進Rho蛋白與GTP結合，從而使Rho蛋白活化?，F(xiàn)已知有60余種GEFs參與調控Rho蛋白的活性。不同的GEFs具有相似的功能結構域，它們都包含1個DH(Dbl homology domain)結構域和1個PH(pleckstrin homologyv domain)結構域，前者與Rho蛋白結合并參與催化其構象的改變，后者參與GEFs在胞膜上定位功能。然而，僅有很少數(shù)的GEFs參與調控血小板中的Rho蛋白[23]。如前所述，p115RhoGEF可以被Gα13亞基激活，進而活化RhoA，進而在血小板內形成新的應力纖維，促進血小板的收縮和遷移運動。除此之外，Vav蛋白是血小板中Rac特異性的GEFs。Vav蛋白家族包括三個成員，分別是Vav1、Vav2和Vav3。血小板活化后，Vav1被激活，促進Rac與GTP結合，活化的Rac可以促進血小板板狀偽足的形成[24,25]。目前，在血小板中并沒有發(fā)現(xiàn)Cdc42特異性的GEFs。

3.2 GAPs對血小板中Rho蛋白的負向調控作用

GAPs促進Rho蛋白GTP的水解，加速其與GDP結合，將Rho蛋白由活性狀態(tài)變?yōu)闊o活性狀態(tài)。目前已經發(fā)現(xiàn)70余種GAPs參與調控Rho蛋白的活性，然而GAPs在血小板中的調控機制并不完全清楚[26]。已知p190RhoGAP可以使血小板中RhoA失活，在血小板的收縮、血塊的彈性回縮的過程中發(fā)揮重要的調控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶激活的血小板中，IQGAP2參與了血小板絲狀偽足的形成，IQGAP2屬于IQGAPs家族，這個家族的成員雖然有GAPs相關結構域，但是其對Rho蛋白發(fā)揮的是正向調控作用。IQGAP2參與血小板絲狀偽足形成作用機制有待于進一步探討[27]。

3.3 GDIs對血小板的調控作用

GDIs可以捕獲GDP結合的Rho蛋白，阻礙GDP從Rho蛋白上分離，從而抑制Rho蛋白的活性，并且阻礙Rho蛋白的胞內轉位[28]。目前已發(fā)現(xiàn)四種作用于血小板的GDIs。蛋白組學研究表明，GDIsα在血小板中高表達，其作用機理并不清楚[29]。GDIs在血小板中的作用機制還有待于進一步研究。

綜上所述，Rho蛋白及其調控分子在血小板細胞骨架重排方面發(fā)揮了至關重要的調控作用，參與了血小板收縮、血小板偽足形成以及血小板顆粒分泌等重要過程。目前我們對于Rho蛋白在血小板中的作用機制并不完全清楚，隨著研究技術的不斷進步，將會發(fā)現(xiàn)新的調控途徑以及靶分子，并探究各種調控機制之間的聯(lián)系和制約。同時，積極探索Rho蛋白在不同血小板相關疾病中其調控方式和調控途徑的相關聯(lián)系。相信隨著研究的不斷深入，Rho蛋白能夠成為血小板相關疾病預防和治療的新靶點。