路文禹，續(xù) 薇

(1.吉林大學第一醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學院第一臨床醫(yī)院 檢驗科)

人體細胞激活或凋亡時會釋放一些亞微米級的囊狀小泡，微粒是代表這些囊狀小泡的一個異質性群體。微粒攜帶大量細胞表面受體、mRNA 以及生物活性物質，標志著其母細胞的特異性生物功能。其所攜帶的 miRNAs 和組織因子等穿梭于細胞/組織之間，參與調控血小板活化、止血以及血栓形成等多種病理生理過程。本綜述將重點討論微粒促進或抑制凝血的同時也具有調控纖溶功能的作用，并探討微?？赡茏鳛樾掳l(fā)現(xiàn)的標志在血栓性疾病中的作用。

1 微粒概念

微粒Microparticles(MPS)是一種直徑為100-1000 nm的囊泡狀結構，最早在1967年由wolf首次發(fā)現(xiàn)，稱其為血小板尖埃[1]。人類血液中的MPS大多來源于血小板，但也會從白細胞、紅細胞、內皮細胞以及腫瘤細胞中釋放，所以在血液中可檢測到血小板源性微粒(PDMP)、內皮細胞源性微粒(EDMP)、單核細胞源性微粒(MDMP)等[2]。MPS形成可被細胞活化或細胞凋亡調控，當細胞活化或凋亡被觸發(fā)后，細胞內鈣離子濃度升高，隨后細胞骨架發(fā)生變化，正常脂質雙分子層發(fā)生改變，富含負電荷的磷脂酰絲氨酸(PS)由內向外出現(xiàn)翻轉，在暴露PS表面同時，MPS可能會從細胞中釋放出來[3]。許多研究表明，在變化過程中，鈣蛋白酶激活起到重要作用，機制可能是鈣蛋白酶有助于限制血小板活化后(PIP)2的形成，而(PIP)2是影響PDMP形成的重要決定因素[3，4]。細胞來源的MP首次被提出的功能就是促凝活性，主要基于其PS暴露和組織因子(tissue factor，TF)的表達[5,6]。另外，MP也可調控炎癥、血管生成、腫瘤或免疫反應，并與靶細胞有動態(tài)的聯(lián)系。因此，MP被認為是細胞交流的重要因子[4]。而近來針對MP的研究發(fā)現(xiàn)，MP有抗凝功能并參與纖溶反應，進一步補充了MP在血栓中的作用[7]。

2 MP在凝血、血栓、纖溶中的作用

2.1 MP促凝功能

MP的促凝功能主要源于其表達的陰性磷脂，尤其是PS，以及主要的凝血系統(tǒng)細胞激活劑組織因子(TF)。在MP形成時，細胞膜磷脂不對稱分布的消失導致PS外翻到膜磷脂雙分子層外側[8，9]。由于帶負電荷，PS通過促進MP表面鈣依賴凝血因子的組裝提高凝血活性，從而促進Xa和凝血酶原酶復合物的形成以及凝血酶的生成[10]。同時攜帶PS和TF的MP促凝活性最高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶vWF的EDMP亞群似乎能夠誘導血小板聚集。

組織因子(TF)是VII和VIIa的受體，是凝血啟動所必需的。組織因子由263個氨基酸殘基組成，包括219個氨基酸的N端胞外結構域、23個氨基酸的跨膜結構域和21個殘基c端胞質結構域，其中包含與半胱氨酸結合的棕櫚酸酯和硬脂酸酯[11，12]。細胞外結構域與細胞因子受體超家族的其他成員是同源的。組織因子結合VIIa因子在細胞表面形成組織因子/VIIa復合物，可激活IX因子和X因子。Jeffrey等科學家通過小鼠動物實驗表明，從造血細胞中提取的組織因子在體內血栓形成的初始階段由微粒傳遞[13]。

血小板MP是健康人體內最主要的MP，此時表達TF和PS的MP數(shù)量很低[14]。血小板MP是否表達TF有爭議性，因為血小板MP上TF依賴的促凝活性似乎有限，因此血小板MP對于健康人和患者體內TF+MP的貢獻似乎很小[15]。紅細胞MP也可能以FXI依賴的方式在鐮刀狀細胞貧血病或血液制品中促進凝血。體外培養(yǎng)條件下，不同的刺激物，如細胞因子、補體和脂多糖(LPS)可刺激內皮釋放攜帶PS和TF依賴的促凝活性的MP。

2.2 MP抗凝功能

在一定條件下，MPS也具有抗凝血的特性，這與MPS的來源和釋放刺激有關。因此，MPS可能有助于調節(jié)抗血栓或血栓形成前血管系統(tǒng)之間的平衡。TF:FVIIa復合物受TF途徑抑制物(TFPI)的調節(jié)[16]。TFPI最初由內皮細胞合成釋放到血液中阻止不合理的凝血激活。TFPI本身也被發(fā)現(xiàn)存在于不同細胞來源的MP上，如內皮、單核細胞以及急性心?；颊呋颊唧w內的循環(huán)MP[17，18]。因此，MP表面的TF和TFPI間的平衡影響著它們的促血栓活性，并因不同的疾病而異。另一個調節(jié)MP的抗凝機制是其表達的抗凝血受體血栓調節(jié)素(TM)和內皮細胞蛋白C受體(EPCR)。血小板MP還發(fā)現(xiàn)能通過激活的蛋白C促進Va的滅活。

2.3 MP纖溶功能

在不同類型MPS中發(fā)現(xiàn)與纖溶相關物質，這些證據(jù)表明MPS是纖維溶解蛋白生成的有效支持物，此發(fā)現(xiàn)進一步增強了MPS在調控凝血平衡中的作用[19]。兩種絲氨酸蛋白酶，尿激酶(u-PA)和組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)可激活纖溶酶原生成纖溶酶[20]。u-PA綁定到細胞表面的特定受體(u-PAR)，如單核細胞、T細胞、中性粒細胞、內皮細胞和成纖維細胞；t-PA主要綁定到神經(jīng)元、突觸細胞、內皮細胞和平滑肌細胞。MP依賴的纖溶酶生成機制包括經(jīng)典的機制，即纖溶酶原結合MP表面的纖溶酶原激活劑，以及新發(fā)現(xiàn)的機制，即MP錨定的u-PA直接激活綁定在血小板、纖維蛋白或細胞外基質蛋白上的纖溶酶原[21]。這些發(fā)現(xiàn)表明，MP可作為纖溶酶生成的有效表面。纖溶酶生成受到纖溶酶原激活劑和抑制劑的高度調控。內皮MP上可檢測到t-PA和它的抑制物PAI-1形成的復合物，這在純化的內皮MP和血栓性血小板減少性紫癜患者體內純化的MP上均可發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)表明MP作為載體可攜帶多種纖溶酶或其抑制物，從而發(fā)揮調控凝血平衡的作用。

3 MP在血栓性疾病中的標志物作用

研究發(fā)現(xiàn)在多種動靜脈血栓性疾病中循環(huán)MP水平均升高，且與疾病的病理生理發(fā)生發(fā)展過程有關[22]。循環(huán)MP檢測的臨床意義可看作是MP產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡[23]。盡管MP因高度促凝參與疾病的惡化過程，但至今仍不清楚MP是心血管疾病的原因還是病理過程的結果，或僅僅只是患心血管病危險因素增大的標志。因此，本部分將著重闡述近期研究成果，并從中發(fā)現(xiàn)一些證據(jù)證實MP可能作為血栓性疾病標志物的相關研究成果。

3.1 動脈血栓

多種危險因素與心腦血管事件相關，Nicolas Amabile通過對844名沒有心血管疾病(心肌梗死史、冠狀動脈供血不足、中風和心力衰竭)的參考者進行分組(以性別、年齡、體重指數(shù)等)分析，通過Guava EasyCyte8 HT進行分析表明，CD144陽性單核細胞微粒血漿水平與幾個心血管危險因素有關，包括較高的甘油三酯水平、高血壓和代謝綜合征，可能原因是高代謝危險因素導致內皮細胞活化或損傷增加[24]，也可能是病理情況下這些增多的MP未被及時清理。進一步發(fā)現(xiàn)，MP可促進單核細胞黏附于血管內皮細胞[25]，這是后續(xù)多種炎癥細胞浸潤以及粥樣斑塊形成的關鍵步驟。Felix Jansen 等科學家通過對人冠狀動脈內皮細胞培養(yǎng)和小鼠模型進一步研究了相關機制：循環(huán)MP促使血管內皮細胞表達粘附分子ICAM-1，并刺激單核細胞表達CD11a等粘附分子受體，MP亦可通過攜帶的miR-222調控ICAM-1的表達[26]。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)從患者粥樣斑塊分離出來的MP可直接將有功能的ICAM-1轉移至靶細胞。并且血小板MP可將促斑塊形成的趨化因子CCL5攜帶至血管內皮細胞，從而促進白細胞在血管內皮的粘附[27]，Stephen 等使用HL-60細胞，轉染表達人P選擇素，發(fā)現(xiàn)在湍流的血液中血小板MP攜帶的P-selectin則可通過促進白細胞-白細胞相互作用助力單核細胞穿透內皮屏障進入內皮下[28]。這些基礎研究表明，病理情況下釋放的MP可影響內皮下空間中白細胞功能及其分布，促進斑塊形成和發(fā)展，從而促進血栓的形成。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，短暫性缺血性中風和冠心病患者循環(huán)血小板MP的水平增高，并且增高的血小板MP與健康男性冠心病的高風險相關[29]。Voukalis等[30]取200例經(jīng)血管造影證實為CAD患者，排除了惡性疾病、炎癥性疾病和除心肌缺血外的嚴重急性缺血患者，取血漿標本使用FACSCalibur流式細胞儀染色后進行分析，證實循環(huán)CD31+/Annexin V+MPs水平是穩(wěn)定型冠心病患者心血管事件的獨立預測因子。Neves等[31],招募了42名腫瘤患者，應用VEGFi進行治療(VEGFi是一種抗血管生成藥物，用于治療實體腫瘤)比較用藥前后的MPs變化情況，從最終取得的39例數(shù)據(jù)中得出，應用VEGFi會導致血管內皮損傷，而由此釋放出來的MPs，是內皮細胞損傷的潛在標志物。M?rtberg等[32]也證明，在晚期腎衰患者中，內皮MP顯著增高，其水平是一個預測嚴重心血管結局的有效標志物。此外，MP依賴的TF活性在急性冠脈綜合癥患者中升高，血管成形術后更高，并在溶栓失敗時依然增高。這表明溶栓失敗可能會導致循環(huán)TF+MP整合到血栓中。盡管多項研究表明眾多血栓性疾病中血小板或白細胞MP水平增高，進一步研究需要測定出血小板和白細胞MP在預測未來血栓性事件的閾值。

3.2 靜脈血栓

大部分有關MP和靜脈血栓(VTE)的研究集中于癌癥患者和癌癥模型小鼠，因為腫瘤細胞在體外釋放大量的TF+MP。鑒于這些MP表達大量的TF，Anubha等研究117名患有包括胰腺疾病、肺栓塞、深靜脈血栓和其它動、靜脈疾病的患者，對這些患者進行MP-TF的連續(xù)監(jiān)測，平均隨訪時間為421天，所有患者MP-TF平均和中位活性分別為2.15±3.8和1.2 pg/ml，在胰腺癌中MP-TF>2.5 pg/ml的中位生存期為98.5天，得知MP-TF活性升高與胰膽管癌和血栓栓塞患者生存率下降有關[33]。Christensen等研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者癌組織中TF表達增加提示預后差[34,35]。Lacroix等[36]在小鼠原位癌模型中測定了腫瘤來源的TF在血栓形成中的作用。研究者將攜帶有活化人源性TF的人胰腺癌細胞種植于裸鼠，發(fā)現(xiàn)凝血瀑布的激活是由于小鼠體內人源的TF導致的。然而只有不到5%的TF活性與循環(huán)MP有關。這些結果表明凝血瀑布的系統(tǒng)性激活所涉及的TF主要是腫瘤本身。這項研究反應了癌癥相關的動靜脈血栓形成的復雜性。研究中涉及的癌癥細胞系、MP的檢測和定義方法、腫瘤的定位，以及在野生型或裸鼠體內用到的人源或鼠源細胞系均會影響疾病的病理生理。然而，重要的是癌細胞MP可能并不是導致促凝狀態(tài)發(fā)展到癌癥相關血栓形成的唯一因素。

事實上，單核MP或癌細胞MP似乎通過攜帶的活化TF直接參與血栓形成，但增多的血小板MP或內皮MP可能也反映出體內高凝狀態(tài)。進一步的研究需要證實不同亞群的MP在動靜脈血栓中的作用。

4 應用和展望

盡管心血管疾病的診治已得到一系列的進展，血栓性疾病仍然是發(fā)展中國家致死率和致殘率的主要原因[37，38]。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，隨著危險因素在全球范圍內的不斷升高，針對危險因素的治療并不能消除心血管疾病的風險[39]。因此，發(fā)現(xiàn)新的標志物和潛在治療方法至關重要。

在2型糖尿病合并代謝綜合癥和微血管并發(fā)癥患者中，血小板源性MPS增加以及在與血栓栓塞并發(fā)癥相關的疾病中，包括DIC、肝素誘導的血小板減少、動脈粥樣硬化性血管疾病會出現(xiàn)MP數(shù)量增加。體個動物試驗也證明，造血細胞來源的組織因子在血栓形成過程中的積累與微粒有關，微粒在血栓形成的初始階段起到傳遞作用。目前對微粒進行檢測最常用的是基本光散射的流式細胞術，可以確定微粒大小和數(shù)目，但針對MP的研究仍然處于初級階段并受到諸多方面的限制。首先，MP和其他類型的囊泡結構大小接近，且在磷脂含量和抗原成分方面的異質性不是很明顯，如何以可重復性的方法去定義和檢測MP成為比較棘手的問題。其次，對于定義稀有MP亞群，迄今并沒有最佳的一致性標志物。最后，我們必須意識到MP僅反應患者血管狀態(tài)的一個方面，并不能除外MP母細胞所做的貢獻。對于未來MP的研究，最好使用更具兼容性的檢測系統(tǒng)，這將為評估血栓事件的發(fā)生風險以及提高檢測治療手段的有效性提供更好的前景。