梅明珠，楊先鋒，龍 騰，張 瓊，趙 靜，田 欽，彭嬌嬌，羅 均，姜 賀，林穎儀，林志雄，郭霄峰

(1 廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一種重要的高度嗜神經(jīng)性人獸共患傳染病，人類和所有溫血動物均易感，感染后一旦出現(xiàn)臨床癥狀，致死率幾乎為100%[1]。目前尚無有效的治療方法，主要依賴接種疫苗進行免疫預(yù)防。

狂犬病病毒屬于單股負鏈RNA病毒目彈狀病毒科狂犬病病毒屬，基因組順序高度保守，為3′-NP-M-G-L-5′?？袢〔《净蚪M只編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白(Nucleoprotein，N蛋白)、磷酸化蛋白(Phosphoprotein，P 蛋白)、基質(zhì)蛋白 (Matrix protein，M蛋白)、糖蛋白(Glycoprotein，G蛋白)和RNA依賴的 RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，L 蛋白)，其中 N、P、L 蛋白與狂犬病病毒RNA共同組成核糖核蛋白體，核糖核蛋白體是狂犬病病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的核心成分[2]。基因重排是改變基因組中的基因順序，從而改變病毒基因的表達和病毒表型?；蛑嘏攀紫葢?yīng)用于水泡性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus，VSV)的研究，該技術(shù)成功改變了VSV的表型[3-5]。陳凱云等[6]和文兆海等[7]利用基因重排技術(shù)將狂犬病病毒SRV9 G基因重排至基因順序第2位，并對基因重排后病毒的遺傳穩(wěn)定性和免疫效果進行了評估。Mei等[8-9]對狂犬病病毒 Flury 高雞胚傳代株 (High egg passage-Flury，HEP-Flury)的N和P基因進行了重排，并對基因重排后病毒在小鼠神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma，NA)細胞和小鼠上的生物學(xué)特性進行了評估，探討了基因重排與病毒表型的相關(guān)性。

狂犬病病毒基質(zhì)蛋白M，是狂犬病病毒最小的結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒粒子的裝配和出芽，調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制平衡[10-12]。M蛋白被認為是決定狂犬病病毒致病性的一個重要因素[12-13]。在前期研究中，Yang等[14]成功拯救了M基因位于第2位和第4位的病毒，并發(fā)現(xiàn)這2個病毒在幼倉鼠腎細胞的傳代細胞 (Clone of baby hamster kidney-21 cell，BSR)上的生長劣于親本毒株rHEP-Flury。由于狂犬病病毒為嗜神經(jīng)病毒[15]，本研究擬進一步對狂犬病病毒親本毒株rHEP-Flury和M基因重排病毒在NA細胞上的基因轉(zhuǎn)錄、表達、生長和擴散進行評估和比較，進而探討M基因重排對狂犬病病毒在NA細胞上的生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞

狂犬病病毒親本毒株rHEP-Flury基因結(jié)構(gòu)順序為3′-N-P-M-G-L-5′，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郭霄峰教授課題組拯救保存。M基因位于第2位的基因重排病毒毒株M2(3′-N-M-P-G-L-5′)和M基因位于第4位的基因重排病毒毒株M4(3′-N-P-G-M-L-5′)由Yang等[14]前期通過反向遺傳操作系統(tǒng)拯救獲得。NA細胞購自武漢生物制品所基因工程室。

1.2 基因重排病毒的RT-PCR鑒定

參照試劑盒說明書，利用 Hipure universal RNA試劑盒(Magen)提取病毒RNA，然后利用HiScript?Ⅱ1st strand cDNA synthesis 試劑盒 (Vazyme)反轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA第1鏈的合成，反轉(zhuǎn)錄引物為隨機引物，最后利用3對引物D-F和P-R、D-F和N-R、D-F和M-R(表1)同時進行PCR擴增鑒定。根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物大小區(qū)分親本毒株rHEP-Flury和M基因重排病毒M2和M4，同時設(shè)置無菌雙蒸水為陰性對照。回收PCR產(chǎn)物，測序并進一步驗證。

表1 用于M基因重排病毒基因順序鑒定的引物Table 1 Primers used for gene order verification of M gene rearranged virus

1.3 熒光定量PCR檢測病毒RNA的表達

為了檢測M基因重排對病毒結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的影響，本研究將親本毒株rHEP-Flury和基因重排病毒M2、M4分別感染NA細胞，感染指數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)設(shè)為 3.00，以確保每個細胞都能感染病毒。34 ℃條件下孵育12 h后，用PBS緩沖液將細胞漂洗1遍后收集細胞。利用HiPure Universal RNA試劑盒(Magen)提取細胞總RNA，參照Mei[8]前期建立的熒光定量PCR對感染細胞中的病毒 Leader RNA(LeRNA)和N、P、M、G、L基因 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平以及基因組RNA(vRNA)的復(fù)制水平進行半定量PCR，以β-actin作為內(nèi)參基因。同時設(shè)置空白細胞對照組和病毒感染平行組，利用FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒的免疫球蛋白(Fujirebio)進行標(biāo)記，以確認每個細胞都感染了病毒。

1.4 Western blot試驗檢測病毒蛋白的表達

將親本毒株rHEP-Flury和M基因重排病毒M2、M4分別感染NA細胞，MOI=3.00，同時設(shè)未接毒的細胞作為空白對照。感染12 h后取出細胞板，每孔加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞1 次，然后加入 100 μL RIPA 蛋白裂解液 (1 mL RIPA 蛋白裂解液加 10 μL PMSF)，混勻后置于冰上裂解 30 min。12 000 r/min 離心 20 min，收集上清，凍存于?80 ℃ 冰箱。經(jīng) Pierce BCA protein assay 試劑盒進行蛋白定量后，調(diào)節(jié)成相同濃度，每份樣品取 15 μL 進行 100 g/L SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%(w)脫脂奶粉封閉1 h，然后用0.1%(w)的PBST緩沖液洗滌2次，最后分別加入抗狂犬病病毒N(按體積比1∶1 000稀釋，浙江同點生物科技有限公司)、P(按體積比1∶500稀釋，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郭霄峰課題組制備)、M(按體積比1:100稀釋，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郭霄峰課題組制備)和G(按體積比1∶500稀釋，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郭霄峰課題組制備)蛋白的單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。設(shè)置β-actin(按體積比 1∶1 000 稀釋，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)為參考蛋白。第2天取出PVDF膜用0.1%(w)的PBST緩沖液洗滌4次，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(體積比1∶50 000，Bioworld)，37 ℃ 條件下孵育 2 h。孵育后用0.1%(w)的PBST緩沖液洗滌4次，再用PBS緩沖液漂洗1次，然后進行曝光，拍照，最后利用軟件Image-Pro Plus 6.0 進行分析。

1.5 病毒在神經(jīng)母細胞瘤細胞上的一步和多步生長曲線

為了解親本毒株rHEP-Flury和M基因重排病毒M2、M4在神經(jīng)細胞上的生長動力學(xué)差異，本研究測定了它們在NA細胞上的一步(MOI=3.00)和多步(MOI=0.01)生長曲線。于第1天接種NA細胞至直徑3.5 cm的細胞培養(yǎng)板中，每板8×105個細胞。第2天先將細胞用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗1遍，然后分別以MOI=0.01和MOI=3.00接種病毒，37 ℃條件下孵育1 h后，棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)基洗 3 遍，然后加入 5 mL 含 5% (φ) FBS 的RPMI1640，置于 34 ℃、5% (φ) CO2環(huán)境中培養(yǎng)。分別于 12、24、48、72 和 96 h 后收集 120 μL 細胞培養(yǎng)上清液進行滴度測定[16]，每個時間點的病毒滴度測2次取平均值，共做3次重復(fù)。

1.6 病毒在神經(jīng)母細胞瘤細胞上的擴散

慢生長和快擴散有利于狂犬病病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)，增強病毒的致病性[17-18]，因此本研究對病毒在NA細胞上的生長和擴散進行了評估。參照文獻[19]，于第1天在12孔板上接種細胞，每孔接種2.5×105個NA細胞，第2天以MOI=0.005分別接種M2、M4和rHEP-Flury。接種完將細胞板置于入34 ℃、5% (φ) CO2環(huán)境中培養(yǎng)，分別于 12、24、36、48、60和72 h后取出，棄上清，用PBS緩沖液洗滌3遍。經(jīng)80% (φ)預(yù)冷丙酮溶液固定后，用FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒的免疫球蛋白進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察和拍照，每孔分別選3個視野進行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因順序的確定

利用3對引物對親本毒株rHEP-Flury和重排病毒M2、M4的基因順序進行確認，結(jié)果顯示：利用引物D-F和P-R對rHEP-Flury、M2和M4進行擴增的產(chǎn)物大小分別為 1 570 、2 380 和 1 570 bp(圖1，泳道 4、7、10)；利用引物 D-F 和 N-R 對 3 種病毒進行擴增的產(chǎn)物大小均為677 bp(圖1，泳道5、8、11)；利用引物D-F和M-R對3種病毒進行擴增的產(chǎn)物大小分別為 2 537、1 541 和 4 205 bp(圖1，泳道 6、9、12)。這些條帶與預(yù)期大小一致，進一步測序比對確定為目的條帶，說明病毒的基因順序沒有改變。

圖1 病毒基因順序的鑒定Fig. 1 Determination of gene order in virus genome

2.2 神經(jīng)母細胞瘤細胞中病毒基因的轉(zhuǎn)錄和表達

將rHEP-Flury和M2、M4感染NA細胞后，對細胞內(nèi)病毒基因合成轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平進行測定，以β-actin作為內(nèi)參基因，利用軟件GraphPad Prism 6.0進行作圖和生物學(xué)統(tǒng)計分析。檢測結(jié)果顯示：病毒感染細胞12 h后，親本毒株rHEP-Flury的病毒vRNA的合成水平和N、P、M、GmRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于M2和M4。病毒N、P、M、G和LmRNA的轉(zhuǎn)錄水平與vRNA的合成水平變化趨勢一致，均為 rHEP-Flury ＞ M4 ＞ M2 (圖2A)。進一步的相關(guān)性分析表明N、P、M、G和LmRNA的轉(zhuǎn)錄水平與病毒vRNA或LeRNA具有顯著相關(guān)性(r＞0.9，P＜0.01)，說明病毒結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與病毒基因組vRNA的合成呈正相關(guān)。

圖2 不同病毒感染的神經(jīng)母細胞瘤細胞中病毒基因的轉(zhuǎn)錄和表達Fig. 2 Transcription and expression of virus gene in neuroblastoma cells infected by different viruses

為了進一步確定結(jié)構(gòu)基因位置對結(jié)構(gòu)基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，本研究對各結(jié)構(gòu)基因mRNA在一次完整的轉(zhuǎn)錄過程中的轉(zhuǎn)錄比例進行了分析。mRNA轉(zhuǎn)錄比例=該基因mRNA轉(zhuǎn)錄子數(shù)/(所有結(jié)構(gòu)基因mRNA轉(zhuǎn)錄子總數(shù)+LeRNA數(shù)量)。結(jié)果顯示，M基因位置距離基因組3′端越遠，MmRNA的轉(zhuǎn)錄比例越低，即 M2＞rHEP-Flury＞M4。M4的G基因被動向前移動一位，轉(zhuǎn)錄比例提高；M2的P基因被動向后移一位，轉(zhuǎn)錄比例降低。此外，這3個病毒的N基因和L基因，雖然基因位置相同，但是轉(zhuǎn)錄比例不完全一致，M基因重排病毒的LmRNA和LeRNA的轉(zhuǎn)錄比例均高于rHEP-Flury(圖2B)。因此推測基因位置影響病毒結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄比例，但是還存在其他影響病毒結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的因素。

利用Western blot對病毒感染的NA細胞中的N、P、M和G蛋白表達的檢測結(jié)果顯示：病毒感染細胞12 h后，M2感染的NA細胞中的N、P、M和G蛋白表達水平明顯低于親本毒株，M4感染的NA細胞中的M蛋白的表達水平明顯低于親本毒株(圖3)。以β-actin作為參考蛋白對細胞中的N、P、M和G蛋白進行半定量，結(jié)果顯示：N、P、M和G這4種結(jié)構(gòu)蛋白的表達水平與mRNA的表達水平基本一致(圖4)，說明病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達受到結(jié)構(gòu)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。

圖3 不同病毒感染的神經(jīng)母細胞瘤細胞細胞中的蛋白表達Fig. 3 Protein expression in neuroblastoma cells infected by different viruses

2.3 病毒在神經(jīng)母細胞瘤細胞中的生長與擴散

當(dāng)MOI=0.01時，病毒在NA細胞中的多步生長曲線顯示：rHEP-Flury、M2和M4在NA細胞上的生長沒有顯著差別，rHEP-Flury的生長和最大滴度優(yōu)于M2和M4；感染48 h前，M4在NA細胞中的生長速度快于M2，48 h后，M2的生長速度快于M4，且M2最大滴度高于M4(圖5A)。當(dāng)MOI=3.00時，病毒在NA細胞中的一步生長曲線顯示：rHEP-Flury、M2和M4在NA細胞上的一步生長曲線沒有明顯規(guī)律，都是在感染48 h左右達到最高峰(圖5B)。進一步對MOI=0.01和MOI=3.00時病毒的最大滴度進行比較，結(jié)果顯示：當(dāng)MOI=0.01時，M2、rHEP-Flury和M4在NA細胞上的生長都優(yōu)于MOI=3.00，其中親本毒株rHEP-Flury差異最顯著。當(dāng)MOI=0.01時，M2、M4在NA細胞中的最大滴度與rHEP-Flury無顯著性差異；當(dāng)MOI=3.00時，M2在NA細胞中的最大滴度顯著高于rHEPFlury(圖5C)。

圖4 不同病毒感染的神經(jīng)母細胞瘤細胞中的蛋白表達Fig. 4 Protein expression in neuroblastoma cells infected by different viruses

圖5 狂犬病病毒在神經(jīng)母細胞瘤細胞中的生長Fig. 5 Growth of rabies virus in neuroblastoma cells

病毒在NA細胞中的擴散試驗結(jié)果(圖6)顯示：病毒感染細胞12 h后，利用FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒的免疫球蛋白進行標(biāo)記，所有細胞均為陰性；當(dāng)病毒感染細胞24 h后，所有處理均有陽性細胞呈現(xiàn)，但數(shù)量上沒有明顯差別；當(dāng)病毒感染36 h后，親本毒株rHEP-Flury陽性細胞數(shù)量略多；當(dāng)病毒感染48 h后，rHEP-Flury和M4幾乎感染了全部細胞，M2此時未能感染全部細胞，這與病毒在NA細胞上的多步生長曲線顯示的感染48 h前，M4在NA細胞中的生長速度快于M2一致；當(dāng)病毒感染60 h后，rHEP-Flury、M2和M4接種的細胞均顯示全部被感染。這表明狂犬病病毒M基因的重排只能降低病毒在細胞間的擴散速度，并不能限制病毒在細胞間的擴散。

圖6 狂犬病病毒在神經(jīng)母細胞瘤細胞中的擴散Fig. 6 Spread of rabies virus in neuroblastoma cells

3 討論與結(jié)論

前期研究表明單股負鏈RNA病毒缺少同源重組的能力，基因順序改變后不會發(fā)生回復(fù)突變[20]，利用RT-PCR方法對本研究M基因重排病毒M2和M4的基因順序進行驗證，結(jié)果表明狂犬病病毒HEP-Flury作為單股負鏈RNA病毒，其基因重排后不會發(fā)生回復(fù)突變。

M蛋白對狂犬病病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制調(diào)節(jié)主要是刺激復(fù)制抑制轉(zhuǎn)錄。本研究顯示當(dāng)病毒感染NA 細胞 12 h 后，病毒N、P、M、G和LmRNA 的轉(zhuǎn)錄水平與vRNA的合成呈正相關(guān)，這可能是因為狂犬病病毒只表達N、P、M、G、L這5種蛋白，它們不僅是狂犬病病毒的功能蛋白還是組成狂犬病病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白，因此表達受到病毒復(fù)制的二級影響[21]。親本毒株rHEP-Flury具有野生型的基因順序，最適合病毒的生長和基因表達，因此最先達到病毒復(fù)制的需求，細胞內(nèi)vRNA水平顯著高于M基因重排病毒[22]?；蛑嘏挪《綧2的M基因從3位移至2位，提高了M基因的轉(zhuǎn)錄比例，但是在病毒感染細胞的早期，其病毒基因組RNA的復(fù)制水平仍低于親本毒株rHEP-Flury和M4，這可能是因為狂犬病病毒的RNA、N、P和L蛋白共同形成核糖核蛋白體，核糖核蛋白體是狂犬病病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的核心成分[2]。此外，Pattnaik等[23]發(fā)現(xiàn)最佳的N、P、L比例能產(chǎn)生最佳的病毒復(fù)制，親本毒株rHEP-Flury和基因重排病毒M4的N、P、L位置沒有發(fā)生改變，因此對N、P、L比例影響較小，病毒復(fù)制速度較快，而M2的M基因從第3位移至第2位，P基因被動從第2位移至第3位，對N、P、L比例影響較大，因此病毒復(fù)制速度較慢?？袢〔《綥eRNA能夠與宿主的La蛋白結(jié)合，抑制細胞RNA的合成[24]。近期研究表明致病性狂犬病病毒的LeRNA能夠干擾狂犬病病毒N蛋白與vRNA的結(jié)合，從而抑制病毒狂犬病病毒的復(fù)制[25]。本研究中M基因重排病毒的LeRNA的轉(zhuǎn)錄比例明顯高于親本毒株rHEP-Flury，重排后病毒增殖速度降低是否與此相關(guān)還有待進一步驗證。

Yang等[14]前期研究顯示：在低感染指數(shù)(MOI=0.1)和高感染指數(shù)(MOI=5.0)時M基因重排病毒在BSR細胞上的生長都劣于親本毒株rHEPFlury，但M4的生長優(yōu)于病毒M2，這與本研究病毒感染細胞12 h后病毒在細胞中的增殖速度一致。但是病毒在NA細胞中生長的最大滴度結(jié)果顯示：當(dāng)MOI=3.00時，親本毒株rHEP-Flury感染的NA細胞上清中病毒滴度顯著低于MOI=0.01時，同時也低于相同感染指數(shù)時的M基因重排病毒，這可能是因為狂犬病病毒HEP-Flury雖然不能誘導(dǎo)NA細胞產(chǎn)生經(jīng)典的細胞病變，但是能夠誘導(dǎo)NA細胞發(fā)生凋亡[26-27]，且在高感染指數(shù)時，誘導(dǎo)細胞凋亡的能力更強[8,28]。因此，高感染指數(shù)時，親本毒株rHEP-Flury在NA細胞中的最大滴度顯著下調(diào)，而狂犬病病毒HEP-Flury不能誘導(dǎo)BSR細胞凋亡，因此病毒的最大滴度與感染指數(shù)無關(guān)。

基因重排病毒M2在NA細胞中生長的最大滴度高于M4，可能與M2在NA細胞中的增殖速度減慢有關(guān)，因為狂犬病病毒的緩慢增殖能夠維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而有利于病毒的復(fù)制。在病毒感染細胞48 h前，M4生長速度快于M2，在細胞間的擴散更快，細胞上清中的病毒滴度高于M2；感染細胞48 h后，幾乎所有的細胞被感染，此時M2的慢生長更利于細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因此后期細胞上清中的病毒滴度高于M4。病毒M2的M基因移至第2位，轉(zhuǎn)錄比例增加可能刺激病毒在單個細胞中的復(fù)制，使病毒滴度升高。此外，G蛋白是狂犬病病毒誘導(dǎo)NA細胞凋亡的主要蛋白[29]，病毒M4在M基因后移一位時G基因被動前移一位，增強了病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的能力，導(dǎo)致病毒在NA細胞上的最大滴度降低。

狂犬病病毒弱毒株的G蛋白能夠誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)凋亡，從而限制病毒擴散[30-31]。雖然HEPFlury的G蛋白能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，但在低感染指數(shù)時，病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的能力不足以限制病毒的擴散，因此病毒的擴散速度與病毒增殖速度一致，M4的擴散速度快于M2。

本研究比較分析了狂犬病親本毒株rHEPFlury和M基因重排病毒M2、M4在NA細胞中的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達、生長及擴散，推測出狂犬病病毒HEP-Flury的基因順序通過影響結(jié)構(gòu)基因在一次基因轉(zhuǎn)錄中的比例，改變病毒在NA細胞中的生長和擴散特性，這為進一步了解病毒結(jié)構(gòu)基因與體外生物學(xué)特性的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。