國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心 （北京 100081）

內(nèi)容提要： 探討了生殖道病原體核酸檢測試劑分析性能評估的要點(diǎn)，闡述了產(chǎn)品臨床前研究需要重點(diǎn)考慮的因素。并以高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑以及沙眼衣原體和/或淋病奈瑟菌檢測試劑為例進(jìn)行了說明，包括企業(yè)參考品的設(shè)置等。

泌尿生殖道感染是全球性的社會及公共衛(wèi)生問題。致病性病原體感染是多種生殖系統(tǒng)疾病的源頭，可引起生殖系統(tǒng)炎癥、不孕癥、淋病以及新生兒感染，還可增加宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等。生殖道感染性疾病診斷方法不規(guī)范、結(jié)果不準(zhǔn)確將會導(dǎo)致患者無法得到及時(shí)治療或者過度治療。隨著核酸檢測技術(shù)的發(fā)展，近年來分子診斷產(chǎn)品層出不窮，包括多種生殖道病原體單項(xiàng)或者聯(lián)合檢測的產(chǎn)品；并且逐漸成為生殖道感染性疾病診斷的主要手段之一。

比如支原體是一種條件致病微生物，有較高的生殖道攜帶率，現(xiàn)已證實(shí)生殖支原體是女性宮頸炎的病因之一。但支原體在生殖系統(tǒng)感染中的具體作用尚未明確，應(yīng)謹(jǐn)慎解讀檢驗(yàn)結(jié)果。多數(shù)生殖器皰疹由單純皰疹病毒2型引起，可頻繁復(fù)發(fā)，也可引起新生兒感染。另外，多項(xiàng)病原體聯(lián)合檢測的產(chǎn)品建議首要關(guān)注臨床需要鑒別診斷的情況，以及對于后續(xù)醫(yī)療決策制定的影響，比如用于指導(dǎo)臨床處置或者藥物治療方案的選擇等。

以下將以兩類典型產(chǎn)品為例，共同探討出于對產(chǎn)品臨床使用安全有效性的考慮，技術(shù)審評對該類產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)階段分析性能評估關(guān)鍵要素的考慮。

1.生殖道病原體核酸檢測試劑的通用要求

1.1 質(zhì)量控制方法的選擇

內(nèi)對照和質(zhì)控品的設(shè)置：其中內(nèi)對照是與目標(biāo)病原體核酸共同參與提取和擴(kuò)增的核酸序列，可以是人的管家基因或者外源加入的質(zhì)粒。陽性質(zhì)控品用于模擬臨床陽性樣本，包含目標(biāo)基因。陰性質(zhì)控品用于對污染造成的假陽性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，可以是樣本收集保存介質(zhì)。注意內(nèi)對照和質(zhì)控品在整個(gè)試驗(yàn)過程中應(yīng)同步參與核酸提取、基因擴(kuò)增和檢測過程，并對其檢測結(jié)果（如Ct值）做出明確的范圍要求[1-3]。

1.2 準(zhǔn)確度和靈敏度的評價(jià)

推薦采用企業(yè)內(nèi)部參考品進(jìn)行陰陽性參考品符合率的評價(jià)，或者采用臨床樣本進(jìn)行方法學(xué)比對研究。

1.3 精密度的評價(jià)

推薦對可能影響精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，評估重復(fù)性和重現(xiàn)性（中間精密度），內(nèi)容包括運(yùn)行內(nèi)的變異和運(yùn)行間、日內(nèi)、日間、批次間、操作者間、儀器間和地點(diǎn)間的變異。方法可采用設(shè)定5～20d的評價(jià)周期，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床分離培養(yǎng)物、臨床樣本或質(zhì)控物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，包含陰性樣本、弱陽性樣本以及中等/強(qiáng)陽性樣本。注意評價(jià)時(shí)納入核酸分離純化步驟。另外建議對不同水平的沙眼衣原體和淋病奈瑟菌樣本排列組合進(jìn)行研究。

1.4 交叉反應(yīng)的評價(jià)

建議使用弱陽性樣本在病毒或細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行評價(jià)。用于驗(yàn)證的病原體或者基因序列種類主要考慮幾種可能性，例如與靶位點(diǎn)存在同源性序列的人基因組序列，可能存在于人類泌尿、生殖道的微生物基因組序列，其他性傳播疾病的病原體基因序列，易引起相同或相似臨床癥狀的其他病原體基因序列，也就是需要鑒別診斷的情形；以及其他常見的病原體。另外，注意充分考慮多種病原體混合感染的情況，避免相互之間可能存在的干擾，例如對于沙眼衣原體和淋病奈瑟菌應(yīng)驗(yàn)證相互之間的交叉反應(yīng)。

1.5 抗干擾能力的評價(jià)

建議使用每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度進(jìn)行研究，可考慮納入內(nèi)源性、外源性和其他已報(bào)道的潛在干擾物質(zhì)。針對不同樣本類型，應(yīng)分別評價(jià)可能存在的干擾情況。例如拭子樣本可選取全血、黏蛋白、宮頸黏液、陰道常用藥物等進(jìn)行驗(yàn)證，尿液樣本可選取血液、膽紅素、抗生素等進(jìn)行驗(yàn)證，并明確不產(chǎn)生干擾的最高限值。

1.6 樣本的適用性

對于該類產(chǎn)品，樣本中病原體的載量十分關(guān)鍵。這就需要對樣本的適用性進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)，以保證檢測結(jié)果的可靠，包括對樣本的收集、運(yùn)輸和儲存、制備或處理的方式進(jìn)行驗(yàn)證。

針對不同的樣本類型（如宮頸拭子或尿道拭子）、取樣部位（如宮頸或陰道），可能有不同的采樣方法以及多種樣本保存介質(zhì)。對于各種類型的樣本以及不同的保存介質(zhì)，建議分別進(jìn)行最低檢測限和精密度等性能的評價(jià)以及樣本穩(wěn)定性的研究。

由于此類產(chǎn)品的樣本采集方法不易實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化操作，并且采樣不當(dāng)可能導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性結(jié)果，建議針對不同的采樣方法與標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行同源樣本的比較研究。

1.7 產(chǎn)品檢驗(yàn)

在對產(chǎn)品分析性能進(jìn)行系統(tǒng)全面的評價(jià)之后，根據(jù)其研究結(jié)果，即可編制產(chǎn)品技術(shù)要求。其中性能指標(biāo)和檢驗(yàn)方法的確定應(yīng)在對其適用性進(jìn)行合理判定的基礎(chǔ)上，符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品的要求，并且相應(yīng)地進(jìn)行產(chǎn)品檢驗(yàn)。

對于HPV檢測試劑，包括核酸檢測和基因分型試劑，如果靶序列為HPV L1基因DNA，應(yīng)使用人乳頭瘤病毒L1基因分型參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并且符合參考品說明書的要求；如果靶序列為非L1基因DNA和全基因組，則適用于人乳頭瘤病毒全基因組分型參考品。對于淋病奈瑟菌檢測試劑，現(xiàn)有適用的淋病PCR試劑盒參考品。對于沙眼衣原體檢測產(chǎn)品，尚無適用的國家參考品；故應(yīng)在科學(xué)合理設(shè)置企業(yè)參考品的前提下，滿足企業(yè)參考品的要求。

1.8 陽性判斷值的確定

陽性判斷值的準(zhǔn)確設(shè)定是產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中具有較高靈敏度和特異性的前提。這里推薦企業(yè)考慮不同地區(qū)流行病學(xué)背景以及人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征（包括性別、地域、種族）的差異，從預(yù)期適用人群中選擇具有代表性的樣本建立陽性判斷值，注意納入一定數(shù)量的弱陽性樣本。

建議采用受試者工作特征曲線（ROC）的方法確定陽性判斷值；同時(shí)可從臨床意義的角度出發(fā)，合理地設(shè)置灰區(qū)。另外，考慮到建立陽性判斷值時(shí)使用的受試者樣本對于目標(biāo)人群的代表性可能不夠充分，鼓勵(lì)企業(yè)后續(xù)通過臨床試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

2.高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑[2]

多年來，宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的診斷主要遵循宮頸細(xì)胞學(xué)、陰道鏡及組織病理學(xué)檢查的三階梯程序。高危型HPV檢測試劑一般用于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查異常患者的分流及30歲以上女性的宮頸癌篩查，與細(xì)胞學(xué)檢查相比具有更高的敏感度以及高級別宮頸病變的檢出率，可以減少陰道鏡轉(zhuǎn)診率，并且能夠延長篩查的時(shí)間間隔。因而有助于臨床診療過程中更加準(zhǔn)確地判斷疾病以及科學(xué)的管理患者。

HPV核酸檢測試劑用于上述分流或?qū)m頸癌篩查時(shí)，應(yīng)覆蓋的HPV基因型別建議包含目前國際公認(rèn)的13種高危型，也可同時(shí)包中等風(fēng)險(xiǎn)型別中的一個(gè)或多個(gè)。如果可檢測的HPV基因型別不能完全涵蓋上述高危型別，則可能造成產(chǎn)品的陰性預(yù)測值無法滿足臨床使用需求。對于基因分型試劑，目前公認(rèn)有臨床意義的用途為16、18型的基因分型檢測用于輔助宮頸癌篩查中HPV核酸陽性檢測結(jié)果的分析是；其他分型的意義尚待進(jìn)一步研究確認(rèn)。另外，低危型HPV一般與低度鱗狀上皮內(nèi)病變或尖銳濕疣相關(guān)，其檢測的臨床意義有限，故不建議包含在產(chǎn)品的覆蓋范圍內(nèi)。

2.1 企業(yè)參考品的設(shè)置

陽性和靈敏度參考品可采用多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株或者臨床分離培養(yǎng)物添加至陰性樣本進(jìn)行制備。陰性參考品則主要考慮分析特異性的評價(jià)，可為經(jīng)確認(rèn)無靶基因序列或者易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的樣本，或者其他病原體樣本。陽性和靈敏度參考品可為感染HPV的細(xì)胞系，或者人工合成的HPV DNA或RNA。值得注意的是無論產(chǎn)品能否進(jìn)行HPV基因分型檢測，均應(yīng)針對所有可檢出的HPV基因型分別設(shè)置陽性參考品和靈敏度參考品。陰性參考品建議納入不在檢測范圍內(nèi)的其他低危型HPV基因型樣本。企業(yè)參考品的基質(zhì)建議與臨床適用的樣本及其收集保存介質(zhì)一致。

2.2 最低檢測限的評價(jià)

對于HPV檢測產(chǎn)品，可針對每種不同的HPV基因型分別配制系列稀釋的樣本，將95%的陽性檢出率水平作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。

3.沙眼衣原體和淋病奈瑟菌檢測試劑[3]

生殖道沙眼衣原體感染和淋病是我國常見的性傳播疾病，可引起的疾病范圍廣泛。例如泌尿生殖系統(tǒng)的化膿性炎癥、不孕或異位妊娠、眼、咽、直腸、盆腔等部位的感染，也可發(fā)生母嬰傳播導(dǎo)致新生兒結(jié)膜炎等。如不及時(shí)治愈可出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥。沙眼衣原體難以培養(yǎng)，現(xiàn)有抗原檢測的靈敏度和特異性均較低，淋病奈瑟菌分離培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果也存在不一致的情況。而采用實(shí)時(shí)熒光PCR等方法的沙眼衣原體和淋病奈瑟菌檢測試劑可用于泌尿生殖道相關(guān)病原體感染的鑒別診斷，同時(shí)，依據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及其他實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行綜合分析，有助于臨床診療過程中更加準(zhǔn)確地判斷疾病。

3.1 企業(yè)參考品的設(shè)置

沙眼衣原體和淋病奈瑟菌核酸檢測試劑用于泌尿生殖道相關(guān)病原體感染的鑒別診斷時(shí)，應(yīng)根據(jù)流行病學(xué)研究證據(jù)，充分覆蓋中國人群中常見的各種沙眼衣原體血清型以及淋病奈瑟菌不同變異來源的參考菌株，以驗(yàn)證產(chǎn)品的檢出能力，并根據(jù)上述要求選取陽性參考品和靈敏度參考品。可用于產(chǎn)品性能評價(jià)的典型沙眼衣原體血清型有D型、E型、F型或G型；淋病奈瑟菌菌株可來源于CMCC或者ATCC，也可使用WHO標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行研究。如果不同血清型或者菌株的最低檢出限存在差異，也應(yīng)分別設(shè)置陽性參考品和靈敏度參考品。陰性參考品則主要考慮檢測特異性的評價(jià)。

3.2 最低檢測限的評價(jià)

建議覆蓋不同來源的多個(gè)血清型或菌株（例如耐藥株），并分別明確代表性血清型或菌株的檢出限。然后，建議在檢出限或附近的濃度對所有可檢出的菌株或血清型進(jìn)行驗(yàn)證。首選與臨床樣本使用相同的基質(zhì)。

4.小結(jié)

本文探討了生殖道病原體核酸檢測試劑臨床前研究中分析性能評估的要點(diǎn)，希望能為產(chǎn)品的設(shè)計(jì)開發(fā)以及注冊申報(bào)提供幫助。同樣也期待能從保障產(chǎn)品性能，指導(dǎo)檢驗(yàn)人員正確使用以及醫(yī)生對于檢驗(yàn)結(jié)果做出合理解釋的角度，為臨床應(yīng)用中面臨的一些問題提示有效的解決方法。