程慶秋,彭 琪,曾小媚,梁 嬌,梁建行,陸小梅

(東莞市第八人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 東莞523325)

不孕不育癥(infertility)指的是未采取任何避孕措施，且性生活正常但無(wú)法成功受孕。不孕不育在我國(guó)并不少見，調(diào)查數(shù)據(jù)表明，約10%-15% 的育齡夫婦存在不孕癥情況[1]。既往研究表明引起不孕的因素主要有環(huán)境因素、遺傳因素、免疫生殖因素、不明原因的不孕等[2-4]?，F(xiàn)如今越來(lái)越多研究指出其中染色體異常是導(dǎo)致不孕不育的重要原因，染色體作為遺傳信息的載體，編碼多種蛋白，控制身體多種性狀的發(fā)生，如果染色體出現(xiàn)異常，必導(dǎo)致所攜帶的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變。染色體異?？煞譃槿旧w數(shù)目異常與結(jié)構(gòu)異常，均能導(dǎo)致機(jī)體正常功能的改變，例如生殖功能障礙或?qū)е缕渌z傳性疾病[5-7]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)染色體異常引起的疾病認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，研究表明閉經(jīng)、自然流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕不育等都與染色體異常有極大地關(guān)系。因此，針對(duì)不孕不育患者中染色體分析也越來(lái)越重視。本文抽取我院2013年8月-2018年8月間收治的242例不孕不育患者為研究對(duì)象，研究不孕不育患者的外周血染色體核型特點(diǎn)，為染色體異常引起的不孕不育提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013年8月1日-2018年8月30日來(lái)我院就診的242例不孕不育患者為研究對(duì)象。其中男35例，女207例。年齡19-43歲，中位年齡為29歲。主要臨床表現(xiàn)：女性表現(xiàn)為原發(fā)性不孕、續(xù)發(fā)性不孕、自然流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、不良妊娠史等；男性表現(xiàn)為不育。

1.2 儀器和試劑材料

美國(guó)Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱、北京優(yōu)晟UWB恒溫水浴箱、上海精宏電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、Olympus顯微鏡cx-41、BD肝素鈉抗凝管、廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的一生駿淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1制片外周血采集與淋巴細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作抽取100例患者外周血3 ml，肝素鈉抗凝。將所取外周血淋巴細(xì)胞1 h內(nèi)接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68-72 h。收獲前2小時(shí)，用5 ml注射器向培養(yǎng)瓶中注入4滴秋水仙素(20 μg/ml)，混勻放回溫箱，將細(xì)胞懸液加入離心管中離心10 min，1 200 rpm；棄上清，加入8 ml溫浴后低滲液，充分吹打均勻后置于37℃水浴箱中水浴25 min，向水浴好的離心管中加入約1.5 ml新鮮配制固定液(甲醇3：冰醋酸1)進(jìn)行固定，輕輕混勻管中液體(15至20下)放置5 min后離心10 min，1 200 rpm；棄上清取沉淀，向沉淀中緩慢加入8 ml固定液，輕輕打勻后水浴箱中固定15 min，離心10 min，1 200 rpm；去除上清液重復(fù)固定1 次。

1.3.2滴片 向沉淀中加入約1.5-2 ml固定液配制成懸液，用吸管將懸液從玻片上方約10 cm處滴到玻片上，每張3-4滴，快速放入80度烤箱中烘干3小時(shí)。

1.3.3顯帶與染色：稱取0.25 g胰酶放入100 ml生理鹽水，再加入1 ml已配制好的3%的Tris液，將磁力攪拌器攪拌；并按照原液：緩沖液=1∶9的比例配制染料，同時(shí)將攪拌好的胰酶液倒入專用染缸，放入水浴箱中預(yù)熱約；取冷卻后玻片胰酶中快速晃動(dòng)，快速?zèng)_洗，染色，流水沖洗，風(fēng)筒吹干，顯微鏡觀察。

1.3.4鏡檢 染色體圖像分析系統(tǒng)分析，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)20-30個(gè)中期分裂相，分析5個(gè)核型，異常情況計(jì)數(shù)100的分裂相，核型結(jié)果依據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)編寫的《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制2009 年(中文版)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)完成染色體核型的分析工作。

2 結(jié)果

2.1 242例不孕不育患者病因分類及染色體異常檢出率統(tǒng)計(jì)

通過外周血染色體核型分析檢查入院收治的242例不孕不育患者，根據(jù)就診原因?qū)?42位患者分為女性不孕組、不良孕產(chǎn)組、男性不育組三組。結(jié)果表明，242位患者中54例患者的染色體異常，其中女性不孕組中染色體異常有31例、不良孕產(chǎn)組中染色體異常有13例、男性不育組中染色體異常有10例。具體分組與染色體異常病例數(shù)見表1。

2.2 54例染色體異常核型及臨床表現(xiàn)

外周血核型分析結(jié)果顯示54例患者染色體異常，其中結(jié)構(gòu)異常8例，占總不孕不育人數(shù)的3.38%；數(shù)量異常1例，占總不孕不育人數(shù)的0.41%；多態(tài)性核型45例，占總不孕不育人數(shù)的18.60%。染色體異常核型例數(shù)分布見表2。

表1 242例不孕不育患者病因分類及染色體異常檢出情況

表2 54例染色體異常核型及臨床表現(xiàn)

2.3 不同原因不孕不育患者核型分析

女性不孕組染色體異常有31例，其中4例染色體結(jié)構(gòu)異常，1例為數(shù)量異常，26例為染色體多態(tài)性，臨床表現(xiàn)均為不孕不育。不良孕產(chǎn)組染色體異常有13例，其中2例為染色體結(jié)構(gòu)異常，11例為染色體多態(tài)性，臨床表現(xiàn)均為先兆流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)。男性不育組染色體異常有10例，染色體結(jié)構(gòu)異常2例，染色體多態(tài)性8例其臨床表現(xiàn)均為男性不育，見表3。

表3 不同原因不孕不育患者核型異常結(jié)果分析

3 討論

染色體異常分為結(jié)構(gòu)異常與數(shù)目異常，結(jié)構(gòu)異常主要分為缺失、重復(fù)、倒位、易位等，而數(shù)目異常主要染色體數(shù)目的增加或減少。既往研究表明染色體異?？稍斐刹辉胁挥?、流產(chǎn)、不良妊娠等疾病，因此，染色體的檢查對(duì)適齡婚育的人尤為重要。目前為止，臨床上常采用人體外周血染色體G顯帶檢查分析人體染色體核型，可有效檢出染色體異常與否，臨床應(yīng)用價(jià)值極高[8]。本文通過外周血染色檢查完成242例染色體核型分析，其中54例患者存在染色體異常，說(shuō)明染色體異常是導(dǎo)致不孕不育的重要因素。

染色體結(jié)構(gòu)異常類型主要包括易位、倒位及缺失等，其中染色體平衡易位是機(jī)體中兩條染色體發(fā)生斷裂后相互交換，僅有位置的改變，沒有可見的染色體片段的增減[9]，無(wú)遺傳物質(zhì)丟失。因此，平衡易位攜帶者臨床表現(xiàn)相對(duì)正常，只是患者生殖細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)引起染色體發(fā)生部分缺失或重復(fù)，從而引起配子平衡打破，導(dǎo)致孕卵死亡與臨床流產(chǎn)發(fā)生率增加[10,11]。而羅伯遜易位為近端著絲粒染色體一種移位形式，即兩個(gè)近端著絲粒染色體在著絲粒部位或附近部位出現(xiàn)斷裂，二者長(zhǎng)臂在著絲粒處相結(jié)合，形成一條長(zhǎng)臂構(gòu)成的衍生染色體，羅伯遜易位者雖只有45 條染色體，但其臨床表現(xiàn)正常。但在形成配子時(shí)候出現(xiàn)異常，導(dǎo)致胚胎死亡而流產(chǎn)或胎兒先天性畸形等[12-14]。由此提示，染色體易位是自然流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕不育、胚胎停止發(fā)育、生育異?；純旱燃膊〉闹匾颉１疚难芯恐腥旧w結(jié)構(gòu)異常8例，其中平衡易位中5例臨床表現(xiàn)為不孕、續(xù)發(fā)性不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；3例為羅伯遜易位者其中2例臨床表現(xiàn)為不孕不育，1例為習(xí)慣性流產(chǎn)。由此可見，染色體結(jié)構(gòu)異常是造成不孕不育的因素之一。

性染色體異?；颊咧?，大多會(huì)性腺發(fā)育不良，副性征不發(fā)育等[15]。第二性征發(fā)育不良是發(fā)育異常的一種，女性第二性征發(fā)育不良多為X染色體異常，其中Turner綜合征和環(huán)形X染色體較常見，臨床表現(xiàn)多為原發(fā)性閉經(jīng)、身材矮小和性腺發(fā)育不良等。性染色體異常的男性患者第二性征發(fā)育異常有多種類型，如性逆轉(zhuǎn)綜合癥，即染色體核型與臨床表型相反，核型是46，XY，但表型卻似女性；或核型為46，XX，但表型卻似男性等；其它異常臨床表現(xiàn)包括小睪丸、陰莖伴尿道下裂、真兩性畸形，即體內(nèi)同時(shí)存在睪丸、輸精管和卵巢、輸卵管等兩性特征[16-18]。本文中性染色數(shù)量異常僅1例，為女患者其核型為45,X，性染色體缺失一條，臨床表現(xiàn)閉經(jīng)。

染色體多態(tài)性指在不同個(gè)體中見到的染色體結(jié)構(gòu)上存在的細(xì)小差異，屬于非病理性性差異[19]。有學(xué)者認(rèn)為此類細(xì)小差異無(wú)特殊功用，認(rèn)為染色體的多態(tài)性通常不具備明顯的表型或病理學(xué)意義[20]，但近年來(lái)的多項(xiàng)研究表明，染色體多態(tài)性具有一定臨床意義[21]。其中多項(xiàng)研究結(jié)果表明染色體多態(tài)性可導(dǎo)致生育障礙，主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、不孕不育等[22-25]。并有研究證明，50%以上的早期流產(chǎn)是由于染色體異常導(dǎo)致，因此患者在妊娠期出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀時(shí)，不應(yīng)盲目保胎，應(yīng)當(dāng)視為一種自然淘汰。本文研究結(jié)果與以往研究相同，異常核型中多態(tài)性核型最多，有45例，占總不孕不育人數(shù)的18.60%，本實(shí)驗(yàn)中染色體多態(tài)性的8例為9號(hào)染色體臂間倒位，研究報(bào)道臂間倒位雖然沒有遺傳物質(zhì)的丟失，但在配子減數(shù)分裂時(shí)造成異常，引起基因不平衡，可導(dǎo)致流產(chǎn)、胚胎死亡或生出畸形兒[26]，本文中患者臨床表現(xiàn)均為不孕、不良孕產(chǎn)史；14例為染色體次縊痕增加，其中男性3例，其余11例為女性，12例均為1號(hào)染色體次縊痕增加，其中1例伴隨染色體片段的延長(zhǎng)，另外2例為16號(hào)染色體次縊痕增加，研究報(bào)道次縊痕區(qū)的著絲?！?jiǎng)恿?fù)合體是細(xì)胞分裂中紡錘絲微管的著力點(diǎn)，是染色體運(yùn)動(dòng)和均等分離的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，其增加或減少會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂時(shí)染色體分裂異常，從而引發(fā)一系列臨床效應(yīng)，比如胎兒出生缺陷、不孕不育、流產(chǎn)等[27,28]，本文14例患者其臨床表現(xiàn)為不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)，與以往研究報(bào)道結(jié)果相同。另外2例為男性Y染色體大小異常，既往研究認(rèn)為小Y染色體中可能由于基因缺失，導(dǎo)致功能喪失，精子生成異常而引起不育，本文中2例患者均臨床表現(xiàn)為不育，表明小Y染色體可能是導(dǎo)致男性生殖異常的主要原因。其余的21例多態(tài)性患者，其中2例為14號(hào)染色體雙隨體，臨床表現(xiàn)續(xù)發(fā)性不孕，剩余19例分別為13、14、15、21、22號(hào)染色體隨體柄增加或減少，隨體變異可導(dǎo)致著絲粒染色體的不分離，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)生時(shí)染色體數(shù)目的異常，引起不孕、流產(chǎn)、死胎等，本實(shí)驗(yàn)中臨床表現(xiàn)為先兆流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕不育，與先前研究結(jié)果一致[26]。因此，染色體多態(tài)性在染色體異常核型中最常見，是引起不孕不育的主要原因。

綜上所述，本文通過外周血染色體分析242例不孕不育患者染色體核型，從染色體結(jié)構(gòu)異位、染色體數(shù)目異常及多態(tài)性核型進(jìn)行分析，結(jié)果表明異常核型均可引起習(xí)慣性流產(chǎn)、原發(fā)或續(xù)發(fā)不孕不育等生殖障礙，導(dǎo)致不孕不育，其中染色體多態(tài)性較為常見。因此，針對(duì)不孕不育患者的染色體檢查尤為重要，明確染色體核型可為治療不孕不育提供有效的參考依據(jù)，避開治療誤區(qū)。