趙洪哲，李新培，范峻豪，宋前進，張 靜，關(guān)平原，溫永俊,

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特 010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），含有一種血清型，具有兩種生物型（細胞病變型cp和非細胞病變型ncp），分為兩種基因型（BVDV1、BVDV2）[1-2]。BVDV是全世界反芻動物最常見病原體，其主要引起牛的發(fā)熱、腹瀉、粘膜病變和白細胞減少癥等[3-4]。BVDV可造成持續(xù)性感染（persistent infection，PI），使得BVDV的擴散非常容易，為BVDV的防治帶來了挑戰(zhàn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[5]。BVDV的核衣殼被糖蛋白Erns、E1和E2所包圍[6-7]，其中，E2蛋白是主要的保護性抗原，能夠誘導(dǎo)中和抗體（neutralizing antiboclies，VN）的產(chǎn)生，保護牛免受BVDV的攻擊[8]。國內(nèi)研究學(xué)者通過大腸桿菌表達E2蛋白并純化，建立BVDV ELISA血清學(xué)檢測方法，但表達的E2蛋白以包涵體的形式大量存在，導(dǎo)致ELISA方法敏感性低[9]。本研究為獲得最佳可溶性E2蛋白，利用生物信息學(xué)軟件分析E2基因的最佳抗原表位，截短、密碼子優(yōu)化后串聯(lián)信號肽合成序列并構(gòu)建至原核表達載體pET-32a(+)，IPTG誘導(dǎo)表達，成功獲得可溶性的E2重組蛋白，為后續(xù)ELISA方法的建立和亞單位疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與主要試劑大腸桿菌BL21（DE3）購自全式金公司；DNA限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉購自O(shè)xoid公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自Sigma公司；PierceTM BCA Protein Assay Kit購自Thermo公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow購自GE公司；BVDV E2單克隆抗體由本實驗室制備。

1.2 主要儀器設(shè)備雙垂直蛋白電泳儀購自百晶生物公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自太倉華美儀器；半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印儀購自美國Bio-Rad公司；超聲破碎儀購自寧波新芝公司；化學(xué)發(fā)光成像儀購自GE公司。

1.3 E2基因生物信息學(xué)分析利用生物信息學(xué)軟件Protparam和DNAStar，對E2基因的基本理化性質(zhì)、抗原性、親水性等進行預(yù)測，截取E2基因優(yōu)勢片段作為候選序列[10]。

1.4 E2基因密碼子優(yōu)化及重組載體的構(gòu)建根據(jù)生物信息學(xué)綜合分析，截取抗原性、親水性等較好的E2基因優(yōu)勢片段。為了提高E2蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達水平，運用稀有密碼子分析工具OptimumGeneTM等軟件進行基因序列優(yōu)化并串聯(lián)信號肽序列。優(yōu)化后的基因序列命名為Opti-E2，將優(yōu)化后的序列引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，合成并連接到pET-32a(+)原核表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-Opti-E2，轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，涂板、挑單個可疑陽性菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素抗性）培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定，陽性克隆送至公司測序，并將該菌液與甘油1∶1混合凍存于-80℃冰箱[11]。

1.5 E2重組蛋白誘導(dǎo)表達及純化取保存的菌液按1∶100的比例接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中（氨芐青霉素抗性），于37℃培養(yǎng)箱中200 r/min搖菌 8～12 h，并連續(xù)傳代3次，以保證大腸桿菌有較高的活力。傳至第4代時，當(dāng)菌液OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，對照組為未誘導(dǎo)的攜帶pET-32a-Opti-E2重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3），37℃ 200 r/min誘導(dǎo)表達9 h后，4℃、 8000 r/min離心10 min，收集菌體；沉淀用PBS重懸，加入終濃度為1 mmol/L的PMSF，冰上超聲破碎菌體，8000 r/min離心10 min，分離上清與沉淀，進行SDS-PAGE分析。按照Ni SepharoseTM6 Fast Flow說明書純化目的蛋白，使用PierceTMBCA Protein Assay Kit測定蛋白濃度。

1.6 Western blot鑒定將純化的蛋白進行SDSPAGE，使用半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（15 V，30 min），5%脫脂乳粉室溫封閉2 h，0.5%PBST洗滌3次；2%脫脂乳粉稀釋鼠源BVDV E2蛋白單克隆抗體（1∶400），4℃孵育過夜，12 h后用0.5%PBST洗滌5次，加入2%脫脂乳粉稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體（1∶4000），室溫搖床孵育 1.5 h，0.5%PBST洗滌5次，避光顯色后拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 E2基因生物信息學(xué)分析

2.1.1 基本理化性質(zhì)分析 參考Singer株（DQ088995.2）BVDV E2基因全長為1122 bp，E2基因編碼374個氨基酸。應(yīng)用在線軟件Protparam預(yù)測BVDV E2蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，E2蛋白分子式為C1889H2951N499O551S29，分子質(zhì)量為42.397 kDa，等電點6.66，為酸性蛋白質(zhì)。E2蛋白在哺乳動物細胞中體外半衰期為1.1 h，酵母菌內(nèi)3 min，大腸桿菌內(nèi)大于10 h。E2蛋白消光系數(shù)為1.308，不穩(wěn)定指數(shù)預(yù)測為34.71，該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白。E2蛋白脂肪指數(shù)是79.47，總體親水性平均值為-0.220。

2.1.2 Protean分析 運用Protean分析軟件分析E2蛋白。結(jié)果顯示：E2蛋白抗原表位在43 aa～116 aa、154 aa～249 aa、271 aa～342 aa時，E2蛋白的親水性較高、抗原指數(shù)高、表面可及性較好（圖1）。

圖1 E2 蛋白的親水性、抗原性和表面可及性的預(yù)測Fig.1 Predicted of hydrophilicity plot, antigenicity index and surface probability of E2 protein

2.2 E2基因密碼子優(yōu)化合成及鑒定根據(jù)生物信息學(xué)分析，截取抗原性、親水性較高的序列154 aa～ 342 aa，共189個氨基酸組成，分子量約22 kDa，對應(yīng)E2編碼區(qū)位點為460 bp～1026 bp，共567 bp。對E2基因序列分析，優(yōu)化前的密碼子適應(yīng)指數(shù)值為0.67，優(yōu)化后的密碼子適應(yīng)指數(shù)值為0.97，該值越大，表示宿主菌對該密碼子的偏愛性越高，可有效的提高該基因在宿主菌中的表達量。優(yōu)化的序列串聯(lián)信號肽后委托公司合成并連接到原核表達載體pET-32a(+)（圖2）。將重組質(zhì)粒pET-32a-Opti-E2用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到2條大小為5900 bp和636 bp左右的片段，均符合預(yù)期大小（圖3）。

2.3 E2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達及純化誘導(dǎo)表達含有重組質(zhì)粒pET-32a-Opti-E2的大腸桿菌，SDS-PAGE分析顯示，表達產(chǎn)物的蛋白大小與預(yù)期蛋白大小一致，為43 kDa，且在上清和沉淀中均有表達，表明溶合表達成功（圖4A）。經(jīng)鎳柱純化后，得到較單一目的條帶（圖4B），測得重組蛋白濃度為 0.5 mg/mL。

圖2 密碼子優(yōu)化后的E2 基因核苷酸序列Fig.2 The gene sequences of E2 after codon optimization

圖3 重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Enzyme digestion identification of pET-32a-Opti-E2

圖4 E2 重組蛋白的表達（A）與純化（B）的SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE identification of the unpurified(A) and purified(B) E2 recombinant protein

2.4 Western blot鑒定結(jié)果顯示在43 kDa左右有明顯單一目的蛋白，表明重組可溶性E2蛋白能夠與特異性抗體結(jié)合，具有較好的生物學(xué)活性（圖5）。

圖5 E2 重組蛋白純化產(chǎn)物的Western blot 鑒定Fig.5 The Western blot analysis after purification of E2 recombinant protein

3 討論

BVDV呈全球范圍內(nèi)分布，導(dǎo)致畜牧業(yè)遭受重大經(jīng)濟損失[12]，目前防治該病的主要方法是疫苗免疫接種并結(jié)合特異性診斷方法來進行種群凈化，其中ELISA方法是一種特異性好、靈敏度高的診斷方法，且適用于大規(guī)模疫情的檢測[13]。高欲燃[14]利用原核表達系統(tǒng)以包涵體的形式表達了BVDV E2蛋白，由于重組蛋白以包涵體的形式大量存在，目的蛋白可能在變性、復(fù)性后不能較好形成天然構(gòu)象，導(dǎo)致目的蛋白失去部分天然活性，因此所建立的ELISA方法與進口試劑盒相比，符合率、敏感性、特異性均小于90%。王宇婷[15]利用原核表達系統(tǒng)以可溶性的形式表達了BVDV E2蛋白，所建立的間接ELISA方法與進口試劑盒符合率為90.9%。表明可溶性的E2蛋白具有更好的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性。

序列優(yōu)化是由于密碼子在不同生物中的使用頻率不同，大腸桿菌表達系統(tǒng)有其偏愛密碼子[16]，將目的基因密碼子優(yōu)化可以提高宿主菌的表達效 率[17]。為了獲得最佳可溶性E2蛋白，本研究利用生物信息學(xué)分析，截取抗原性、親水性最佳區(qū)域，將序列進行大腸桿菌稀有密碼子優(yōu)化后串聯(lián)pelB信號肽構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒，進行IPTG誘導(dǎo)表達；引入pelB信號肽可以將目的蛋白轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間，有利于目的蛋白的正確折疊與構(gòu)象；原核表達載體pET-32a(+)含有T7強啟動子和自身溶解性高的多肽序列TrxA，可有效提高目的蛋白產(chǎn)量及可溶性表 達[18-19]；宿主菌BL21（DE3）為蛋白酶缺陷型菌株，能夠有效避免重組蛋白的酶解[20]。

本研究成功表達了BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白，經(jīng)Western blot鑒定，表達的E2重組蛋白特異性好，可與BVDV E2單克隆抗體特異性結(jié)合，E2重組蛋白的溶合表達為BVDV間接ELISA檢測方法的建立和亞單位疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。