顧成元 秦曉健 戴波 朱耀 朱煜 許 華 葉定偉

（復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科-復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系 上海 200032）

目前前列腺癌根治術是臨床局限性前列腺癌的標準治療方法，但10年內(nèi)術后復發(fā)率高達30%［1］。前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）和病理指標對于術后復發(fā)的預測特異度和敏感度較低［2］，臨床亟需能夠預測術后復發(fā)的生物標記物，理想的生物標志物將有助于對患者復發(fā)風險分層進行精準輔助治療從而改善預后。

研究顯示雌激素通過氧化代謝在前列腺癌的進展過程中起重要作用［3］。CYP1B1是一種在雌激素代謝羥基化過程中的關鍵酶。雌激素（如雌激素酮E1、雌二醇E2）可經(jīng)氧化代謝生成兒茶酚雌激素和雌激素醌，而CYP1B1催化兒茶酚雌激素生成致癌性4-OHE。這些氧化代謝產(chǎn)物具有DNA損傷效應，導致前列腺癌發(fā)生及持續(xù)進展。CYP1B1蛋白表達量在前列腺癌組織中明顯高于良性前列腺增生組織［4］。

由于CYP1B1在雌激素代謝過程中的重要作用，CYP1B1基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）有可能通過改變基因表達水平影響前列腺癌進展。目前尚無CYP1B1基因多態(tài)性與前列腺癌根治術后復發(fā)的關聯(lián)性研究。本研究旨在探索CYP1B1基因多態(tài)性對于前列腺癌根治術后生化復發(fā)的相關性，評估其預測價值。

資料和方法

研究對象納入2006年至2009年間在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院接受前列腺癌根治術的426例局限性前列腺癌患者，中位隨訪時間37.7個月，術后每3個月隨訪PSA變化。將術后血清PSA水平連續(xù)兩次超過0.2 ng/mL定義為生化復發(fā)（biochemical recurrence，BCR）。臨床病理資料和隨訪信息通過電子病歷系統(tǒng)檢索獲得。排除術后接受輔助內(nèi)分泌或放療的患者。

候選SNP選擇及基因分型檢測利用人類基因組數(shù)據(jù)庫NCBI，查找CYP1B1基因，確定研究區(qū)域。通過HapMap數(shù)據(jù)庫查找本研究區(qū)域的SNP位點基因分型數(shù)據(jù)信息，獲取漢族人群中CYP1B1基因及其延伸區(qū)域內(nèi)所有SNP位點基因分型數(shù)據(jù)。將獲取的基因分型數(shù)據(jù)導入Haploview 4.2軟件，篩選出最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05的SNPs，導出連鎖不平衡圖譜及數(shù)據(jù)。通過對連鎖不平衡圖譜的數(shù)據(jù)比對，挑選出每個單倍域內(nèi)r2≥0.8且LOD＞3的SNPs，選取平均r2值最大的一個SNP作為該單倍域標簽SNP。共確定8個標簽SNP位點（rs10916、rs162562、rs2551188、rs9341266、rs9341248、rs162549、rs1056827、rs1056836）。

基因分型檢測方法如文獻所述［5］。外周血樣本來自復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院組織庫，采用德國Qiagen公司試劑盒，按照操作步驟提取全基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量，BioPhotometer核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）檢測DNA的濃度和純度，定量標化至50 ng/μL，于4 ℃下分裝備用。采用TaqMan探針法進行基因分型，即利用Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活力對探針本身進行酶切，Taqman探針的兩端分別標記有熒光基團和對應的淬滅基團。設計引物和探針定制于美國ABI公司。CYP1B1 rs1056836的引物序列F（5'-3'）：TGTCAACCAGTGGTCTGTGAATC，R：（5'-3'）TGGATCAAAGTTCTCCGGGTTA。探針序列（5'-3'）：ATGA-CCCAC/GTGAAGTG。反應體系5 μL，包括1 μL DNA模板、0.125 μL引物探針、2.5 μL TaqMan Universal Master Mix以及1.375 μL去離 子水。在每 個384孔反應板中設置陰性空白對照。擴增條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。擴增之后用ABI PRISM 7900HT熒光定量PCR儀檢測熒光分布情況，并應用SDS 2.4軟件進行基因分型。隨機抽取10%的樣本進行重復試驗和驗證，基因型符合率為100%。

CYP1B1 mRNA檢測上述426例病例中，127例保存了前列腺癌旁組織樣本。按照Trizol試劑（美國Invitrogen公司）的說明提取總RNA。PCR反應體系總體積20 μL，其中模板cDNA 1 μg，10×PCR緩沖液（15 mmol/L MgCl2）2.4 μL，Taq-DNA聚合酶1U，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，5 mmol/L上游引物和下游引物各l μL，加ddH2O至20 μL。依次預變性、變性、退火、延伸。擴增產(chǎn)物為GAPDH，452 bp；CYP1B1，297 bp。引物CYP1B1上游（5'-3'）：GCTGCAGTGGCTGCTCCT；下游（5'-3'）：CCCACGACCTGATCCAATTCT。

統(tǒng)計學方法計量資料以表示，數(shù)值變量用非配對的t檢驗，分類變量用χ2檢驗。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗。采用Cox比例風險回歸模型，對可能的混雜因素（年齡、PSA、Gleason評分等）進行調(diào)整，計算風險比（hazard ratio，HR）和95% 可信區(qū)間（95% confidence interval，95%CI）來評估各種基因型與前列腺癌術后復發(fā)風險的相關性。采用Kaplan-Meier法在顯性遺傳模式下進行無復發(fā)生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計分析使用SAS 9.1軟件完成。

結(jié) 果

患者基線特征見表1。共426例患者，中位隨訪時間為37.7個月，其中100例術后出現(xiàn)生化復發(fā)（23.5%）。全組患者1年無生化復發(fā)率為94.1%，3年無生化復發(fā)率為78.6%，其中57例接受內(nèi)分泌治療，43例接受挽救性放療聯(lián)合內(nèi)分泌治療。術前血清PSA、病理分期、淋巴結(jié)侵犯、Gleason評分與生化復發(fā)相關（P＜0.01）。

表1 研究對象的臨床病理特征Tab 1 Clinicopathologic characteristics of thestudy populations ［n（%）］

426例患者基因型分布見表2，對上述臨床病理特征進行調(diào)整后分析顯示，8個標簽SNP位點中發(fā)現(xiàn)CYP1B1 rs1056836與前列腺癌根治術后生化復發(fā)相關（CG基因型，HR：0.65，95%CI：0.33～0.93，P=0.025），而其余7個SNP位點與前列腺癌根治術后生化復發(fā)之間無關聯(lián)性，所以CYP1B1 rs1056836是獨立預后因素。

在顯性模型中，受突變基因影響并表現(xiàn)出性狀的定義為暴露組，即暴露于遺傳因素——rs1056836多態(tài)性中突變型G。因為是顯性模型，所以CG和GG都表現(xiàn)出突變性狀，CC為野生性狀。根據(jù)定義，CG/GG為暴露組，CC為非暴露組。本研究將CYP1B1 rs1056836中CC型與CG/GG型攜帶者兩者相比，CC基因型攜帶者術后進展至生化復發(fā)時間較短，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（圖1，P=0.036）。

進一步分析CYP1B1各SNP位點與mRNA表達的關系（圖2），與CG/GG基因型相比，rs1056836 CC基因型的CYP1B1 mRNA表達量顯著升高，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.025），其余7個SNP位點與CYP1B1 mRNA表達量之間未見相關性。

表2 CYP1B1標簽SNPs與前列腺癌根治術后生化復發(fā)的關系Tab 2 Associations between CYP1B1 tag SNPs and biochemical recurrence ［n（%）］

討 論

CYP1B1 rs1056836是位于外顯子3的非同義替換SNP，導致亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。之前關于CYP1B1基因多態(tài)性與前列腺癌關系的相關報道，其研究終點為前列腺癌發(fā)病，但結(jié)果并不一致［6-8］。薈萃分析對這些研究進行了總結(jié)，結(jié)果顯示在亞洲男性中rs1056836與前列腺癌發(fā)病風險相關，與C等位基因攜帶者相比，G等位基因攜帶者的前列腺癌發(fā)病風險為1.52倍（95%CI：1.20～1.92），但在高加索人群中并無關聯(lián)［9］。造成這一差異的原因可能有各種族基因型分布頻率不同、環(huán)境因素影響和前列腺癌發(fā)病率差異等。CYP1B1 rs1056836的等位基因頻率在不同的種族間具有顯著的差異，其中G等位基因在亞洲人群中的頻率約為16.76%，顯著低于高加索人群的38.66%，兩者間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）［10］。本研究首次以前列腺癌根治術后生化復發(fā)為研究終點，在漢族人群中觀察CYP1B1基因多態(tài)性與前列腺癌的關聯(lián)性。結(jié)果顯示，本組漢族人群中rs1056836基因頻率約為22.3%，低于既往文獻報道的G等位基因在高加索人群中的頻率。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)CYP1B1 rs1056836與前列腺癌根治術后生化復發(fā)之間有關聯(lián)，CG基因型較CC基因型的生化復發(fā)風險顯著降低（HR：0.65，95%CI：0.33～0.93，P=0.025）。

既往有研究觀察CYP1B1 rs1056836與前列腺癌侵襲性之間的關系，如Beuten等［11］納入393例高加索人，將Gleason評分≥7定義為高侵襲性前列腺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CYP1B1 rs1056836 CC基因型攜帶者相比，GG基因型攜帶者患高侵襲性前列腺癌的幾率降低約55%，差異具有統(tǒng)計學意義（OR：0.45，95%CI：0.24～0.84，P=0.01）。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認為CYP1B1可能在前列腺癌的進展階段起關鍵作用，其表達升高后，CYP1B1可通過上調(diào)Sp1引起上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和激活Wnt/β-Catenin信號通路來增強腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移［12］。

已有研究報道CYP1B1 SNP位點通過改變雌激素正常生理代謝或表達水平可影響個體的腫瘤發(fā)病風險［3-4］。據(jù)此，本研究假設位于CYP1B1編碼區(qū)的rs1056836可能改變基因表達水平，進而導致前列腺癌的術后復發(fā)。隨后的實驗證實rs1056836確實與CYP1B1 mRNA表達相關。與正常前列腺細胞相比，前列腺癌細胞中CYP1B1的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高［13］。CYP1B1活性受到芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、內(nèi)源性雌激素和雌激素受體等多種機制調(diào)節(jié)。在侵襲性前列腺癌中AhR異常激活，CYP1B1催化雌激素氧化代謝生成兒茶酚雌激素和雌激素醌增多，最終導致前列腺癌細胞增殖和遷移增加［14］。

本研究存在一定的局限性，如病例數(shù)和隨訪時間相對有限，缺乏蛋白水平的驗證，具體的生物學機制也有待進一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)CYP1B1編碼區(qū)SNP rs1056836與前列腺癌根治術后生化復發(fā)風險有關，CC基因型攜帶者復發(fā)風險顯著升高。對于行前列腺癌根治術的患者進行該位點的基因分型有助于判斷復發(fā)風險，臨床上可針對高?；颊叻e極采取輔助治療以改善預后。