李仁禮 向曉輝 周子棟 張文成 夏時海

1武警后勤學(xué)院，天津 300309；2武警特色醫(yī)學(xué)中心消化疾病研究所，天津 300162；3天津市肝臟胰腺纖維化與分子診療重點實驗室，天津 300162

急性胰腺炎(AP)是由多種病因引起的胰腺的一種炎癥狀態(tài)，胰腺腺泡細胞受損和胰蛋白酶原的激活是AP發(fā)生的最初病理生理過程[1-2]，其中細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)與抗氧化系統(tǒng)失衡是胰腺腺泡細胞受損的主要因素[3]?；钚匝踔饕▎螒B(tài)氧(O)、超氧化物(O2-)、羥基(OH-)和過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)高濃度H2O2可引起細胞氧化應(yīng)激損傷甚至壞死，伴隨相關(guān)應(yīng)激蛋白表達增加[5]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)是一種高度保守的核蛋白，作為DNA伴侶蛋白參與DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)，而細胞外的HMGB1作為一種損傷相關(guān)分子模式參與炎癥和免疫反應(yīng)，在多種疾病中發(fā)揮著復(fù)雜的病理生理功能[6-10]。然而H2O2在胰腺腺泡細胞HMGB1表達和釋放過程中的作用機制尚不清楚。氧化苦參堿(oxymatrine, OM)是從苦參中提取出的一種生物堿，具有抗炎、抗病毒、抗纖維化等藥理作用[11]。本課題組前期研究證實OM能抑制脂多糖誘導(dǎo)的胰腺腺泡AR42J細胞的炎癥反應(yīng)[12]。本研究觀察OM對H2O2刺激后AR42J細胞HMGB1表達和分泌的影響，探討HMGB1在AP發(fā)病機制中的作用。

材料與方法

一、H2O2作用于AR42J細胞的最佳濃度選擇

AR42J細胞購于ATCC庫(American type culture collection)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。采用四唑鹽(MTT)比色法檢測細胞存活率。取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化后制成細胞懸液，以5×103個/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h，更換終濃度分別為0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mmol/L H2O2的培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，孵育24 h后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長490 nm處的吸光值(A490值)，繪制細胞生長曲線，確定H2O2作用于AR42J細胞的最佳濃度。

二、AR42J細胞分組與干預(yù)

取對數(shù)生長期AR42J細胞，以1.0×106個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，隨機分為對照組、H2O2組、H2O2+OM組。H2O2組及H2O2+OM組加入等容積的H2O2(H2O2最佳濃度)，對照組加入等容積的三蒸水，H2O2+OM組在加入H2O2前0.5 h加入OM(終濃度0.5 g/L[12])，培養(yǎng) 24 h后收集細胞及細胞培養(yǎng)上清液。

三、AR42J細胞HMGB1蛋白表達量檢測

應(yīng)用RIPA蛋白裂解液抽提細胞總蛋白， BCA法定量蛋白，行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞HMGB1蛋白表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參。GAPDH抗體(1∶1 000)、HMGB1抗體(1∶1 000)均購自美國Proteintech公司，HRP標記山羊抗兔IgG(1∶1 000)、ECL發(fā)光液均購自北京Solarbio公司。應(yīng)用Image J軟件掃描條帶，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值比作為蛋白表達量。

四、AR42J細胞上清液HMGB1蛋白水平檢測

收集6孔板中各組細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心20 min，離心半徑5 cm。收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測上清液中的HMGB1水平。HMGB1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司，按說明書操作。使用ELISAcalc軟件繪制標準曲線，計算樣品濃度。

五、AR42J細胞內(nèi)HMGB1蛋白定位檢測

采用免疫熒光法檢測HMGB1在細胞內(nèi)的定位。取各組AR42J細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% TritonX-100室溫放置20 min，山羊血清封閉1 h，滴加HMGB1一抗(1∶75)，4 ℃濕盒中孵育12 h，避光滴加羊抗兔IgG-FITC二抗(1∶250，北京Solarbio公司)，37℃孵育1 h，滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，即用型，北京Solarbio公司)核染10 min后進行封片，熒光倒置顯微鏡下觀察，攝片，應(yīng)用Image-ProPlus 6.0進行分析。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同濃度H2O2對AR42J細胞生存率的影響

0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mmol/L H2O2處理AR42J細胞24 h后的生存率分別為100%、(96.24±6.21)%、(95.38±3.15)%、(77.20±3.65)%、(16.26±2.74)%、(2.72±0.16)%(圖1)。0.04、0.08 mmol/L H2O2對AR421細胞的生存率無顯著影響，0.16、0.32、0.64 mmol/L H2O2均能顯著抑制AR42J細胞的生存率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為10.83、52.95、10.57，P值均<0.05)，因0.32、0.64 mmol/L H2O2處理后的細胞生存率太低，故后續(xù)實驗選取0.16 mmol/L作為H2O2處理AR42J細胞的適宜濃度。

二、H2O2及OM對AR42J細胞HMGB1蛋白表達的影響

對照組、H2O2組、H2O2+OM組細胞培養(yǎng)24 h后，AR42J細胞HMGB1蛋白相對表達量分別為0.69±0.02、1.04±0.04、0.82±0.02(圖2)，H2O2組顯著高于對照組，H2O2+OM組顯著低于H2O2組，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為8.59、4.92、4.50，P值均<0.05)。

三、H2O2及OM對AR42J細胞HMGB1蛋白分泌量的影響

對照組、H2O2組、H2O2+OM組細胞培養(yǎng)上清液中HMGB1蛋白水平分別為(2.68±0.07)、(4.84±0.13)、(3.97±0.10)μg/L，H2O2組顯著高于對照組，H2O2+OM組顯著低于H2O2組，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為20.37、7.57、14.92，P值均<0.05)。

注：H2O2為過氧化氫

圖1不同濃度H2O2對AR42J細胞生存率的影響

注：H2O2為過氧化氫；OM為氧化苦參堿；HMGB1為高遷移率族蛋白B1

圖2對照組(1)、H2O2組(2)和H2O2+OM組(3)AR42J細胞HMGB1蛋白表達

四、H2O2及OM對AR42J細胞HMGB1蛋白胞內(nèi)定位的影響

對照組、H2O2組、H2O2+OM組AR42J細胞胞質(zhì)內(nèi)HMGB1蛋白占細胞HMGB1蛋白總量的比例分別為(10.7±1.9)%、(35.7±2.5)%、(27.3±1.7)%(圖3)，H2O2組AR42J細胞胞質(zhì)中HMGB1蛋白占比顯著高于對照組，而H2O2+OM組AR42J細胞胞質(zhì)中HMGB1蛋白占比顯著低于H2O2組，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為11.31、3.90、9.29，P值均<0.05)。提示AR42J細胞HMGB1蛋白定位于胞核，H2O2處理后AR42J細胞內(nèi)HMGB1蛋白由胞核向胞質(zhì)移位，預(yù)先用OM干預(yù)能抑制HMGB1蛋白從胞核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。

討 論

胰腺炎早期以無菌性損傷為特征，胰腺腺泡細胞損傷甚至壞死，細胞內(nèi)容物從受損或死亡的細胞中釋放到細胞外，其作為損傷相關(guān)分子譜(damage associated molecular patterns, DAMPs)，在AP的致病過程中起著核心作用[13-15]。DAMPs主要包括HMGB1、熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)、DNA、ATP等，它們具有類細胞因子、趨化因子或生長因子的活性，通過血液循環(huán)運輸?shù)饺砀魈帲瑥亩鴮⒕植拷M織損傷與全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)聯(lián)系起來，導(dǎo)致隨后發(fā)生的多器官功能衰竭(MOF)，甚至死亡[14,16]。HMGB1作為一種最典型和廣泛研究的DAMPs，在AP的發(fā)展過程中起著非常重要的作用，它既可由應(yīng)激細胞主動分泌，也可由死亡細胞被動釋放，作為一種警報信號反映細胞的應(yīng)激狀態(tài)[17-18]。細胞實驗表明，HMGB1能夠通過TLR4或RAGE受體激活巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞和T細胞等，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，進而擴大和加重炎癥反應(yīng)[17-20]。動物實驗表明，急性壞死性胰腺炎小鼠血清HMGB1水平明顯高于正常小鼠[21]。臨床研究表明，AP患者的血清HMGB1水平升高，且與疾病的嚴重程度呈正相關(guān)[22-23]；而抑制HMGB1的表達和釋放以及阻斷TLR4或RAGE受體均能有效緩解胰腺炎癥[18,20,24-27]。

ROS是細胞代謝過程中關(guān)鍵信號分子，調(diào)控包括蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)、酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、MAPKs和NF-κB等多種信號分子，在細胞生存和死亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28]。H2O2作為活性氧中的一種，低濃度時能夠引起細胞抗氧化防御系統(tǒng)激活，而高濃度則引起細胞氧化應(yīng)激損傷甚至壞死[5]。本實驗根據(jù)MTT結(jié)果，采用0.16 mmol/L H2O2誘導(dǎo)AR42J細胞氧化應(yīng)激，結(jié)果顯示H2O2組細胞內(nèi)HMGB1蛋白表達和分泌到細胞上清液中的HMGB1均顯著增多，表明H2O2能夠誘導(dǎo)AR42J 細胞HMGB1表達和釋放。H2O2處理AR42J細胞后發(fā)生了HMGB1由胞核向胞質(zhì)再向胞外轉(zhuǎn)移，提示HMGB1可能在胰腺炎的發(fā)病機制中起重要作用。應(yīng)用OM干預(yù)后，HMGB1的表達和釋放均較H2O2組顯著下降，HMGB1蛋白由胞核向胞質(zhì)的移位顯著減弱，提示OM可能通過穩(wěn)定核膜與胞膜進而減輕氧化應(yīng)激所造成的細胞損傷。

注：H2O2為過氧化氫；OM為氧化苦參堿；HMGB1為高遷移率族蛋白B1；DAPI為4′，6-二脒基-2-苯基吲哚

圖3H2O2及OM對AR42J細胞內(nèi)HMGB1蛋白移位的影響 3A～3C：對照組；3D～3F：H2O2組；3G～3I：H2O2+OM組；3A、3D、3G為蛋白定位(免疫熒光，×400)；3B、3E、3H為DAPI染色；3C、3F、3I為疊加

綜上分析，鑒于細胞損傷和死亡所釋放的DAMPs在AP致病過程中的重要驅(qū)動作用，提示HMGB1可能是治療胰腺炎的重要靶點，而OM可能是改善胰腺炎癥的有效藥物。HMGB1結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，探討HMGB1的作用機制能夠更好地理解局部組織損傷與SIRS之間的關(guān)系，以便選擇更有針對性的治療方案，為胰腺炎的治療提供新的策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突