鄧穗燕，易江華，蔡文瑩，夏 勇△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.皮膚科，廣東廣州510150；3.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣東廣州 510120)

紅色毛癬菌是最常見(jiàn)的也是世界范圍內(nèi)傳播最廣的皮膚癬菌[1]，可侵犯皮膚角質(zhì)層、甲板和毛發(fā)，導(dǎo)致體股癬、手足癬、甲癬和頭癬等各種皮膚癬菌病。目前，國(guó)內(nèi)診斷的主要依據(jù)為真菌直接鏡檢和培養(yǎng)，鏡檢和培養(yǎng)相結(jié)合的正確診斷率為50%～75%[2]，導(dǎo)致1/4～1/2的皮膚癬菌病無(wú)法確診，且傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)。鑒于紅色毛癬菌引起的皮膚癬菌病在皮膚病中的高發(fā)病率及它在環(huán)境中的廣泛分布，有必要尋找一種臨床可行的、簡(jiǎn)便快捷的鑒定方法。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新興診斷技術(shù)，其通過(guò)檢測(cè)微生物的肽/蛋白質(zhì)指紋圖譜，經(jīng)軟件處理并與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，可在數(shù)分鐘內(nèi)完成對(duì)微生物種、屬水平的鑒定[3-4]。但由于絲狀真菌菌絲難以挑取、細(xì)胞壁厚、培養(yǎng)條件等原因，使得質(zhì)譜對(duì)絲狀真菌的鑒定效果不佳[5]。蛋白質(zhì)提取及純化的效率是上機(jī)前的主要影響因素，目前常用的方法有直涂法(包括傳統(tǒng)直涂與改良直涂法)和甲酸提取法[3-4]，前者操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)菌蛋白提取效果好；后者是BRUKER公司推薦使用的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，操作相對(duì)繁瑣、耗時(shí)。商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法對(duì)絲狀真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)、甲酸提取法進(jìn)行前處理，而在臨床工作中，待測(cè)菌是通過(guò)固體培養(yǎng)法所得，前處理方法使用基于改良直涂法的“雙甲酸夾心法”(由于絲狀真菌菌絲難以附著于靶板上，筆者在改良直涂法的基礎(chǔ)上先加1 μL 70%甲酸，起到黏附菌絲作用)，這可能是導(dǎo)致實(shí)際臨床應(yīng)用質(zhì)譜鑒定絲狀真菌效果不佳的原因之一。待鑒定菌株的培養(yǎng)條件和前處理方法與建庫(kù)菌株保持一致或許更有利于檢測(cè)效率的提高[4-6]。本研究利用固體培養(yǎng)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，用雙甲酸夾心法和甲酸提取法作為蛋白提取方法，分別建立2個(gè)紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)，再以雙夾心甲酸法和甲酸提取法對(duì)21株紅色毛癬菌臨床分離株進(jìn)行蛋白提取和質(zhì)譜鑒定，通過(guò)對(duì)2個(gè)自建庫(kù)和商品庫(kù)之間鑒定得分的比對(duì)，從而對(duì)自建庫(kù)的鑒定效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年4—12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科送檢的“皮膚真菌培養(yǎng)”紅色毛癬菌陽(yáng)性標(biāo)本作為驗(yàn)證菌，所有驗(yàn)證菌通過(guò)測(cè)序確認(rèn)為紅色毛癬菌，多次送檢的同一患者只收集首株菌。自建庫(kù)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株為紅色毛癬菌ATCC28188，購(gòu)自中國(guó)江門(mén)市凱林貿(mào)易有限公司。

1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；真菌培養(yǎng)箱購(gòu)自中國(guó)上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；高速離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)北京白洋醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司；加樣槍購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；FlexControl3.4、FlexAnalysis、MALDI Biotyper3.1軟件購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；乳酸酚棉藍(lán)染液購(gòu)自中國(guó)珠海貝索公司；乙腈、甲酸、三氟乙酸、α-氰基-4羥基肉桂酸(HCCA)、蛋白多肽標(biāo)準(zhǔn)品(BTS)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自廣州中南化學(xué)試劑有限公司；雙蒸水、菌種保存液、沙保羅葡萄糖瓊脂(SDA)固體培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)江門(mén)凱林貿(mào)易有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離株的培養(yǎng) 將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 28188、臨床標(biāo)本(皮屑、甲屑等皮膚標(biāo)本)接種在SDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 28188培養(yǎng)5 d建立MALDI-TOF MS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，用于形態(tài)學(xué)鑒定的臨床標(biāo)本培養(yǎng)5～15 d至成熟狀態(tài)，被篩選為用于驗(yàn)證MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床分離株復(fù)蘇培養(yǎng)5 d作質(zhì)譜鑒定。

1.3.2臨床分離株的菌種鑒定 取一清潔載玻片，滴加乳酸酚棉藍(lán)染液1滴，然后用透明膠帶粘取菌落貼于玻片上，加上蓋玻片并稍壓以除去氣泡，在顯微鏡下觀察孢子和分生孢子的形態(tài)、生長(zhǎng)方式及菌絲特征，同時(shí)結(jié)合菌落生長(zhǎng)速度、形態(tài)、質(zhì)地和顏色等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。將紅色毛癬菌接種于菌種保存液中，-80 ℃保存，后續(xù)用于測(cè)序確認(rèn)和驗(yàn)證MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.3上機(jī)前標(biāo)本的蛋白提取 將紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株分別用雙甲酸夾心法和甲酸提取法作為蛋白提取方法，利用MALDI-TOF MS對(duì)菌株進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。雙甲酸夾心法：(1)吸取1 μL 70%甲酸于靶板上，用牙簽挑取菌落，在甲酸干燥前把絲狀真菌均勻點(diǎn)涂到靶板上，待干；(2)吸取1 μL 70%甲酸于靶板上，待干；(3)吸取1 μL HCCA基質(zhì)液涂敷到標(biāo)本上，待干燥后上機(jī)。

甲酸提取法：(1)牙簽挑取適量菌絲轉(zhuǎn)移到盛有300 μL純水的小型離心管中；(2)用移液槍反復(fù)吹打，渦旋1 min，在小型離心管中形成均勻的混懸液；(3)添加 900 μL無(wú)水乙醇，渦旋1 min，13 000 r/min離心2 min，去上清液；(4)再次離心，通過(guò)移液槍除去殘余乙醇；(5)將20 μL 70%的甲酸水溶液加入沉淀顆粒中，移液槍反復(fù)吹打，渦旋混勻；(6)加入20 μL乙腈，移液槍吹打混勻，13 000 r/min離心2 min；(7)將1 μL上清液移取到MALDI-TOF MS靶板上，晾干；(8)將1 μL HCCA基質(zhì)液涂敷在標(biāo)本上，待干燥后上機(jī)。

1.3.4數(shù)據(jù)采集 使用FlexControl3.4軟件采集圖譜，采用正線性模式，質(zhì)量2 000～20 000，激光頻率為60 Hz，加速電壓19.98 kV，延遲提取電壓17.98 kV，聚焦電壓5.99 kV，延遲時(shí)間為150 ns，每個(gè)靶點(diǎn)設(shè)激光隨機(jī)射擊6個(gè)點(diǎn)，每次射擊40次，用于建庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)菌株制備8個(gè)靶位，每個(gè)靶位采集3張指紋圖譜；用于驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)的驗(yàn)證菌每株制備1個(gè)靶位，每個(gè)靶位采集1張指紋圖譜。每次采集前均用BTS進(jìn)行質(zhì)量校正，采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)試劑進(jìn)行，獲得的譜峰與已知譜峰的m/z進(jìn)行比對(duì)校準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)試劑在大腸埃希菌ATCC 25922特征峰的基礎(chǔ)上增加了核糖核酸酶A(13 682×103)和肌紅蛋白(16 952×103)的譜峰。校正時(shí)，需至少有4個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的峰相符，且峰強(qiáng)度至少為200。

1.3.5建立標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù) 應(yīng)用 Biotyper3.1軟件中的MSP Creation模塊建立標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)。采用Biotyper MSP Creation Standard Method方法，將標(biāo)準(zhǔn)菌株的24份質(zhì)譜圖創(chuàng)建為該菌種的預(yù)測(cè)波譜(MSP)，構(gòu)建紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)。以雙甲酸夾心法作為標(biāo)準(zhǔn)菌株蛋白提取方法所構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)命名為“雙甲酸夾心法自建庫(kù)”；以甲酸提取法作為標(biāo)準(zhǔn)菌株蛋白提取方法所構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)命名為“甲酸提取法自建庫(kù)”。

1.3.6MALDI-TOF MS鑒定 應(yīng)用Biotyper3.1軟件中的Identification模塊檢測(cè)菌種，采用Biotyper MSP Identification Standard Method方法，分別選取本實(shí)驗(yàn)建立的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)和商品庫(kù)，調(diào)入不同蛋白提取方法的待測(cè)菌株的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定，并記錄鑒定得分，以第1位鑒定結(jié)果為紅色毛癬菌的得分作為該菌的鑒定得分，無(wú)質(zhì)譜峰或鑒定不準(zhǔn)判為0分，分析培養(yǎng)條件及蛋白提取方法對(duì)MALDI-TOF MS鑒定效果的影響。

2 結(jié) 果

2.1紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)的建立 本研究構(gòu)建了2種不同蛋白提取方法的紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)軟件統(tǒng)計(jì)生成相關(guān)波譜數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫(kù)，用于紅色毛癬菌鑒定。見(jiàn)圖1。

注：A表示雙甲酸夾心法；B表示甲酸提取法。

圖1不同蛋白提取方法建立的紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)譜圖

2.2MALDI-TOF MS對(duì)21株臨床分離株的鑒定結(jié)果 不論以雙甲酸夾心法抑或甲酸提取法作為待測(cè)菌的蛋白提取方法，甲酸提取法自建庫(kù)與Bruker商品庫(kù)合并使用的鑒定得分顯著高于其余2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與形態(tài)學(xué)鑒定的匹配度最高；雙甲酸夾心法自建庫(kù)與Bruker商品庫(kù)合并使用的鑒定得分與Bruker商品庫(kù)單獨(dú)使用的得分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 MALDI-TOF MS各數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)21株紅色毛癬菌的鑒定結(jié)果

續(xù)表1 MALDI-TOF MS各數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)21株紅色毛癬菌的鑒定結(jié)果

注：與“甲酸提取法自建庫(kù)+Bruker商品庫(kù)”比較，*P<0.05；與“雙甲酸夾心法自建庫(kù)+Bruker商品庫(kù)”比較，#P>0.05。

3 討 論

紅色毛癬菌是一種非常重要的致病菌，尋求一種快速、準(zhǔn)確的鑒定方法對(duì)該菌引起的皮膚癬菌病的診斷和治療有著十分重要的意義。目前對(duì)該菌的鑒定除了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定手段外，還有各式各樣的分子生物學(xué)方法，如特異引物PCR、PCR-RFLP、隨機(jī)引物PCR、巢式PCR和質(zhì)譜鑒定等[7-11]。形態(tài)學(xué)鑒定主要依靠培養(yǎng)后鏡下觀察其形態(tài)特點(diǎn)和產(chǎn)孢情況，并結(jié)合菌落生長(zhǎng)的形態(tài)和顏色等鑒定[12]，這需要檢驗(yàn)人員有較高的專業(yè)知識(shí)水平和豐富的絲狀真菌鑒定經(jīng)驗(yàn)，且該方法耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要10～15 d，對(duì)于一些形態(tài)不典型或不產(chǎn)孢的菌株往往鑒定不到種，對(duì)臨床的早期診斷和治療造成困難。分子生物學(xué)的方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的不足，但其標(biāo)本前處理步驟繁瑣而未能在臨床實(shí)驗(yàn)室普及。MALDI-TOF MS可以通過(guò)檢測(cè)皮膚癬菌中固有的特異性蛋白形成的特征性圖譜從而實(shí)現(xiàn)對(duì)皮膚癬菌的快速鑒定[13]。質(zhì)譜在微生物鑒定中穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、快速且結(jié)果準(zhǔn)確，大大縮短了報(bào)告時(shí)間，已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室[14]。

與細(xì)菌不同，絲狀真菌的細(xì)胞壁含有較多的幾丁質(zhì)成分，細(xì)胞壁厚且韌性和穩(wěn)定性都較強(qiáng)，導(dǎo)致絲狀真菌胞內(nèi)核糖體蛋白釋出困難，這是質(zhì)譜鑒定真菌效果不如細(xì)菌的主要原因。甲酸提取法是Bruker系統(tǒng)推薦的絲狀真菌質(zhì)譜分析前處理方法，其中甲酸溶液起破壞細(xì)胞壁的作用，乙腈則有助于胞內(nèi)核糖體蛋白的進(jìn)一步釋出。該方法要反復(fù)離心洗滌，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，故臨床實(shí)驗(yàn)室更偏好用直涂法。此外，質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性受許多因素影響，如培養(yǎng)基基質(zhì)、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間、菌株蛋白提取方法等。培養(yǎng)條件的改變會(huì)造成微生物表面蛋白、脂質(zhì)、多肽等物質(zhì)的改變[15]。一些研究發(fā)現(xiàn)，真菌生長(zhǎng)的早期與晚期對(duì)質(zhì)譜質(zhì)量峰的數(shù)量和強(qiáng)度存在顯著的差異[16-18]。李鳳琴等[19]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)條件的改變，會(huì)導(dǎo)致微生物體內(nèi)生物大分子發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)信息的不準(zhǔn)確。要解決這一問(wèn)題，就必須盡可能的豐富菌種數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，并且在鑒定待測(cè)菌時(shí)，應(yīng)統(tǒng)一其培養(yǎng)條件。庫(kù)充數(shù)據(jù)庫(kù)的研究近幾年逐漸增加，2017年西班牙一個(gè)實(shí)驗(yàn)室用390株曲霉對(duì)自建庫(kù)做了驗(yàn)證分析，95.5%達(dá)到了菌種水平[20]。TRIEST等[21]在對(duì)自建庫(kù)的研究中獲得了91%的菌種鑒定率。MALDI-TOF MS用于絲狀真菌鑒定的研究已有很多，但針對(duì)紅色毛癬菌研究的報(bào)道卻不多見(jiàn)，尤其是標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)的建立更是空白。

RANQUE等[22]選取了58種共625株絲狀真菌做質(zhì)譜鑒定，鑒定正確率為89%。LING等[23]對(duì)33篇MALDI-TOF MS鑒定絲狀真菌的文獻(xiàn)做了meta分析，表明了質(zhì)譜鑒定絲狀真菌雖然沒(méi)有像鑒定細(xì)菌和酵母菌那樣取得滿意的效果，但相比其他方法鑒定率仍然較高。BECKER等[24]的研究表明質(zhì)譜鑒定絲狀真菌有85.6%的正確鑒定率，而形態(tài)學(xué)只有61.5%。但在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)譜鑒定絲狀真菌的準(zhǔn)確性卻達(dá)不到以上報(bào)道的水平?？赡芘c以下因素有關(guān)：以上報(bào)道的實(shí)驗(yàn)均使用商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)時(shí)使用的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法對(duì)絲狀真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)、甲酸提取法進(jìn)行前處理，而在臨床工作中，待測(cè)菌是通過(guò)固體培養(yǎng)法所得，前處理方法使用簡(jiǎn)便快速的雙甲酸夾心直涂法，這可能是導(dǎo)致實(shí)際臨床應(yīng)用質(zhì)譜鑒定絲狀真菌效果不佳的原因之一。液體培養(yǎng)較少被用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，本實(shí)驗(yàn)以SDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d所得的紅色毛癬菌，分別用2種蛋白提取方法建立MS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，在操作流程上可以與常規(guī)皮膚癬菌鑒定工作進(jìn)行更好地銜接，還可以不斷豐富數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的圖譜，逐漸提高自建庫(kù)的鑒定能力。

本研究建立了一種相對(duì)簡(jiǎn)單、有效的標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)建立方法及紅色毛癬菌的質(zhì)譜鑒定方法。從表1可以看出，以甲酸提取法作為待測(cè)菌的蛋白提取方法、使用“甲酸提取法自建庫(kù)+Bruker商品庫(kù)”的鑒定分值為(1.817±0.222)分，高于“雙甲酸夾心法自建庫(kù)+Bruker商品庫(kù)”和“Bruker商品庫(kù)”，相同培養(yǎng)基質(zhì)及相同培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)的紅色毛癬菌提供該菌特有的質(zhì)譜信息，保證本實(shí)驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)菌信息的準(zhǔn)確性和原有數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性，待測(cè)菌株培養(yǎng)條件的統(tǒng)一避免了生物大分子的過(guò)度改變，確保鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)室以SDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d所得的紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，以甲酸提取法作前處理建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，與原有商品庫(kù)合并使用，對(duì)21株紅色毛癬菌的鑒定得分明顯高于原有商品庫(kù)。即便如此，在以簡(jiǎn)易的雙甲酸夾心法作為待測(cè)菌的蛋白提取方法，使用“雙甲酸夾心法自建庫(kù)+Bruker商品庫(kù)”并沒(méi)有獲得滿意的鑒定效果，鑒定分值為(1.257±0.433)分。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，即使是建庫(kù)時(shí)統(tǒng)一與待測(cè)菌的蛋白提取方法，也未能取得更好的鑒定效果，雙甲酸夾心法操作簡(jiǎn)便，但用于紅色毛癬菌鑒定的準(zhǔn)確性欠佳，鑒定得分低，充分提取菌體蛋白是提高質(zhì)譜鑒定得分的關(guān)鍵因素。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)建立紅色毛癬菌MS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，豐富已有的商品數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)，提高鑒定準(zhǔn)確性，這將為其他皮膚癬菌MALDI-TOF MS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供更好的借鑒，MALDI-TOF MS將會(huì)成為皮膚癬菌診斷領(lǐng)域不可或缺的工具。