王心儀，周 娟，劉 穎，應(yīng)斌武

(四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041)

EB病毒(EBV)是一種線性雙鏈DNA病毒，成人感染率高達90%，存在于人類B淋巴細胞內(nèi)，通過血液循環(huán)造成全身性感染[1]，大量病毒通過誘導(dǎo)細胞增殖、抑制細胞分化及凋亡，導(dǎo)致各種增生性疾病[2]。病毒感染可累及多個器官，疾病癥狀的多樣化易造成漏診、誤診，給臨床診斷帶來一定困難。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法可判斷人體是否近期或曾經(jīng)感染過EBV，但檢測結(jié)果不能反映EBV的活動狀況。目前核酸載量測定是診斷EBV感染相關(guān)疾病最常用的實驗室診斷方法[3]，通常使用實時熒光定量PCR(qPCR)方法檢測EBV-DNA用于確認(rèn)EBV的感染。而基于EBV感染后疾病分布特點，根據(jù)各疾病發(fā)病率的不同，其EBV-DNA載量也不同[4]，但在西南地區(qū)常出現(xiàn)實驗室結(jié)果和臨床診斷不符的情況，導(dǎo)致qPCR檢測結(jié)果對臨床診斷支持能力不足，推測西南地區(qū)EBV-DNA載量有其自身特征。目前微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)方法的靈敏度高和絕對定量的能力在分子診斷方面具有巨大的潛力，作為一種絕對定量的方法[5]，可作為檢測EBV-DNA載量的金標(biāo)準(zhǔn)。

故本研究旨在解決臨床工作中用qPCR方法檢測EBV載量與臨床診斷不符的問題，一方面可以準(zhǔn)確反映西南地區(qū)的EBV載量特點，另一方面比較ddPCR和qPCR方法檢測EBV載量的能力，以ddPCR為標(biāo)準(zhǔn)，評價qPCR的性能，并為臨床提供可能的解決方案。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年9-12月四川大學(xué)華西醫(yī)院510例疑似EBV感染的患者血漿標(biāo)本。510例患者中，免疫功能不全者201例；淋巴瘤128例；未治療的鼻咽癌38例；治療后的鼻咽癌143例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 qPCR采用EBV載量定量試劑盒，購自中國湖南圣湘生物科技有限公司；ddPCR使用全自動PCR儀，購自美國Bio-Rad公司，型號QX200。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本收集 納入高度懷疑EBV感染的510例1 mL標(biāo)本血漿，在4 ℃低溫條件下，12 000 r/min離心10 min后棄沉淀吸取上清液，分裝標(biāo)記保存至-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2ddPCR檢測EBV核酸載量 按照DNA提取試劑盒具體說明書進行DNA的提取，在羅氏Q480儀器上進行PCR擴增，循環(huán)條件包括在95 ℃ 10 min； 94 ℃ 30 s 40個循環(huán)；56 ℃ 60 s；98 ℃ 10 min。擴增后，將PCR板轉(zhuǎn)移至Bio-Rad QX200進行檢測，并通過Quanta-Soft軟件獲得數(shù)據(jù)。

1.3.3qPCR檢測EBV核酸載量 qPCR檢測擴增BamHI-W片段，用已知EBV-DNA 水平的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；提取血漿EBV-DNA具體按照說明書進行，將待測標(biāo)本嚴(yán)格按照說明書進行PCR擴增。按照試劑盒說明：EBV-DNA定量以400 copies/mL為界值判斷結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1疑似EB感染患者的EBV載量特征分析 510例疑似EBV感染病例中，男性302例，女性208例?；赿dPCR檢測結(jié)果，男性陽性率為68.5%，女性陽性率為61.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.681，P>0.05)?；颊咂骄挲g(45±16)歲，隨著年齡上升，陽性率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。初診未治鼻咽癌患者中，陽性率最高為(81.6%)，其次依序為治療后鼻咽癌(73.4%)，免疫功能不全者(72.6%)，淋巴瘤患者(68.0%)，各病例組之間感染率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.235，P<0.05)。對EBV病毒載量進行分析，發(fā)現(xiàn)EBV總的感染者病毒載量中位數(shù)為360 copies/mL，其中初診未治鼻咽癌患者中位病毒載量最高，為4 590 copies/mL，治療后鼻咽癌患者中位病毒載量下降為430 copies/mL，免疫力低下者中位病毒載量為130 copies/mL，而淋巴瘤患者中位病毒載量840 copies/mL。見表1。

表1 510例疑似感染者EBV分布情況

2.2兩種檢測方法定性結(jié)果比較 qPCR和ddPCR分別檢測同一血漿標(biāo)本，以400 copies/mL 作為qPCR的臨界值時，與ddPCR結(jié)果做比較，結(jié)果顯示用qPCR檢測的大多數(shù)EBV陽性患者(252/369)被漏檢。通過回顧qPCR反應(yīng)曲線，發(fā)現(xiàn)252個漏檢標(biāo)本中，有231個有典型的S型擴增曲線。見表2。

表2 兩種檢測方法定性結(jié)果比較(n)

2.3qPCR和ddPCR陽性檢測結(jié)果相關(guān)性分析 按照試劑盒qPCR的臨界值，分析qPCR結(jié)果≥400 copies/mL時，與ddPCR結(jié)果相關(guān)性呈中度相關(guān)(r=0.533，P<0.05)。qPCR結(jié)果<400 copies/mL時，與ddPCR結(jié)果相關(guān)性呈弱相關(guān)(r=0.299 5，P<0.05)。見圖1。

注：A表示qPCR結(jié)果≥400 copies/mL時，與ddPCR的相關(guān)性；B表示qPCR結(jié)果<400 copies/mL，與ddPCR的相關(guān)性。

圖1qPCR和ddPCR陽性檢測結(jié)果相關(guān)性分析

2.4基于ddPCR結(jié)果嘗試優(yōu)化qPCR的臨界值 以ddPCR檢測結(jié)果為基準(zhǔn)，根據(jù)ROC曲線每一點對應(yīng)的靈敏度和特異度，選擇適合的靈敏度和特異度，繪制ROC曲線，AUC=0.871。此時，得到在qPCR方法中EBV-DNA對應(yīng)的臨界值(qPCR)=10 copies/mL，靈敏度為0.824，特異度為0.780。利用優(yōu)化后的臨界值，重新判定EB陰性、陽性，在510例標(biāo)本中，qPCR方法的靈敏度由0.317提高至0.943，且假陰性得到大幅度降低，從0.683降為0.057。見圖2、表3。

圖2 qPCR的ROC曲線

表3 兩種檢測方法定性結(jié)果比較(n)

3 討 論

EBV感染對人體免疫功能影響甚大，與機體許多疾病發(fā)生機制相關(guān)，且EBV是第1個被證實與癌癥發(fā)生相關(guān)的病毒，由EBV感染導(dǎo)致的胃癌、鼻咽癌等癌癥患者死亡逐年增加[6-7]。而EBV-DNA載量檢測不僅是EBV感染存在的直接證據(jù)，也可評估服用免疫抑制劑治療自身免疫性疾病或監(jiān)測移植后患者的治療效果，或輔助診斷淋巴瘤和鼻咽癌及判斷預(yù)后，因此早期發(fā)現(xiàn)EBV感染對阻止惡性疾病進程有至關(guān)重要的意義。但實際工作中，成人EBV感染的病理表現(xiàn)復(fù)雜，早期診斷較為困難。且臨床實踐中EBV-DNA載量大多非常低，qPCR方法靈敏度難以滿足臨床需求，作為EBV篩檢指標(biāo)漏檢率高，可能為臨床診斷帶來困擾。故本研究采用了ddPCR和qPCR兩種方法同時檢測510例血漿標(biāo)本病毒DNA載量，探討不同地區(qū)各疾病組之間病毒載量間差異性，最終為西南地區(qū)EB感染臨床診斷與實驗室結(jié)果不符的問題提供解決思路。

本研究基于EBV的上述特點用ddPCR方法檢測了EBV感染相關(guān)疾病免疫功能不全者、淋巴瘤患者、初診未治鼻咽癌患者及治療后鼻咽癌患者血漿中EBV-DNA水平。510例疑似EBV感染者的EBV中位數(shù)載量為360 copies/mL，與其他低發(fā)區(qū)相比，寧夏地區(qū)EBV感染者EBV-DNA載量為5.01×103copies/mL[8]，山西地區(qū)EBV感染的病毒中位數(shù)載量為3 356 copies/mL[9]，西南地區(qū)EBV感染者EBV-DNA載量遠遠低于其他低發(fā)區(qū)，結(jié)果顯示EBV-DNA載量高低與低發(fā)區(qū)無關(guān)。其中初診未治鼻咽癌患者中位病毒載量為4 590 copies/mL，治療后鼻咽癌患者中位病毒載量下降為430 copies/mL，免疫力低下者中位病毒載量為130 copies/mL，而淋巴瘤患者中位病毒載量為840 copies/mL，楊雀飛等[10]研究得出鼻咽癌患者EBV-DNA載量為4 250 copies/mL；喻晶等[11]研究得出，鼻咽癌患者EBV-DNA載量為1.1×106copies/mL，淋巴瘤患者EBV-DNA數(shù)值為6.9×103copies/mL，自身免疫疾病患者EBV-DNA數(shù)值為630 copies/mL，將西南地區(qū)各疾病組與高發(fā)區(qū)EBV-DNA載量相比，顯示西南地區(qū)EBV感染各疾病組的EBV-DNA載量均低，且疾病組載量規(guī)律相同。國內(nèi)外文獻對于EBV陽性檢測率報道在70%～90%，中位拷貝數(shù)為103～104copies/mL[12-14]，將不同地區(qū)結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，本院檢測出的EBV-DNA水平明顯較低。

實驗室使用試劑盒臨界值：400 copies/mL定性EBV感染。qPCR檢測EBV感染以400 copies/mL為界值，≥400 copies/mL時，ddPCR與qPCR的EBV-DNA測定水平值呈中度相關(guān)(r=0.533，P<0.05)，<400 copies/mL時ddPCR與qPCR的EBV-DNA測定水平值度呈弱相關(guān)(r=0.299 5，P<0.05)。此結(jié)果證明載量在400 copies/mL以下不能準(zhǔn)確檢測，有漏檢情況，此臨界值不能滿足EBV-DNA低載量水平的檢測，也證明了目前臨床qPCR檢測手段無法準(zhǔn)確為臨床在EBV感染提供有效的證據(jù)，但由于目前國際上還沒有采用統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)，無法確立統(tǒng)一的臨界值作為陽性參考值，這可能會影響檢測中的靈敏度和特異度[15]，所以西南地區(qū)低水平的EBV-DNA的檢測可能需要更為靈敏的方法去檢測。

qPCR方法是目前臨床EBV-DNA常用的篩檢方式，qPCR要求目的基因拷貝數(shù)相對較高，對目的基因做出相對定量分析[16]，本研究中，ddPCR和qPCR兩種方法的定性結(jié)果比較后發(fā)現(xiàn)，qPCR漏檢率高達68.3%，在漏檢的252例標(biāo)本中，231例標(biāo)本有明顯擴增曲線，推斷患者有EBV感染，說明在西南地區(qū)qPCR方法篩檢低水平載量的EBV-DNA，情況不理想，因而需要尋找更為靈敏的方法去檢測。近來，ddPCR發(fā)展迅速，用ddPCR檢測血漿能實現(xiàn)對EBV-DNA的絕對定量，ddPCR由Bio-Rad公司于2011年推出[17]，該技術(shù)在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，而后進行PCR擴增，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例，可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或水平，是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，其檢測敏感性高達0.001%，而ddPCR不僅兼具qPCR優(yōu)點，無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，更不受擴增效率的影響，有研究利用逆轉(zhuǎn)錄和ddPCR技術(shù)靈敏度高和精確性強的特點測定甲流病毒中的去離子顆粒[18-19]，而有許多研究證實ddPCR可作為EBV-DNA檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，即可實現(xiàn)對EBV-DNA的絕對定量，尤其是微量標(biāo)本的絕對定量[20]，TAKUYA[21]根據(jù)ddPCR檢測EBV的BamH1-W片段拷貝數(shù)計算EBV-DNA載量，并設(shè)定EBV-DNA載量的截止值。

根據(jù)目前狀況，可針對臨床實驗室普遍使用的EBV-DNA檢測的qPCR法進行優(yōu)化，適當(dāng)提高qPCR方法的靈敏度，優(yōu)化其臨界值，降低其漏檢率，高度有效地篩檢EBV感染，更好地指導(dǎo)臨床診斷。但在此研究中，嘗試對qPCR進行優(yōu)化，以ddPCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制qPCR的ROC曲線，AUC 0.871，找到新的臨界值(qPCR)=10 copies/mL，靈敏度82.4%，特異度78.0%。用新的臨界值進行驗證，結(jié)果顯示對于極低EBV-DNA載量，qPCR存在假陽性可能，且假陽性為37.5%，在這個臨界值下，檢驗效能雖得到大幅度提高，但特異度降低，所以還是尋找靈敏度更高的方法更為可靠，比如ddPCR。

4 結(jié) 論

西南地區(qū)臨床實踐中EBV載量大多非常低，常規(guī)qPCR方法靈敏度難以滿足臨床需求，采用ddPCR方法檢測EBV-DNA載量能為臨床診斷EBV感染提供更有利的支持。