李 萍，趙四林，陳煜楓，胡 燕，許 濤，謝小兵△

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與病理中心；2.呼吸內(nèi)科；3.急診科，湖南長沙 410007)

自2019年12月由武漢首次報(bào)道新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)感染以來，疫情迅速在湖北省及中國其他地區(qū)蔓延[1-2]。目前，由感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)所導(dǎo)致的COVID-19已被納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預(yù)防和控制措施。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會辦公廳/國家中醫(yī)藥管理局辦公室發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第五版修正版)》[3]，常見的臨床表現(xiàn)有發(fā)熱和(或)呼吸道癥狀，疾病早期白細(xì)胞總數(shù)正?；驕p少，或淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。對確診病例的診斷需具備以下病原學(xué)證據(jù)之一：(1)呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性；(2)呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒基因測序，與已知的SARS-CoV-2高度同源。因此準(zhǔn)確、及時(shí)的病原學(xué)核酸檢測已成為診斷COVID-19的重要環(huán)節(jié)。

用于呼吸道病原體核酸檢測的標(biāo)本有上呼吸道標(biāo)本(口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物等)和下呼吸道標(biāo)本(深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液和肺組織活檢標(biāo)本等)。目前，進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測最常用的標(biāo)本類型為口/鼻咽拭子，而據(jù)現(xiàn)在已開展的SARS-CoV-2核酸檢測情況來看，咽拭子標(biāo)本核酸檢出率偏低、靈敏度不高。本文報(bào)道2例COVID-19確診病例的診療經(jīng)過,并分析采用不同類型標(biāo)本檢測SARS-CoV-2核酸的檢出情況，為臨床診斷COVID-19時(shí)如何選擇標(biāo)本類型和如何提高核酸檢出率提供參考。

1 臨床資料

病例1：女，34歲。主訴“咳嗽咳痰8 d”?；颊咦栽V2020年1月22日曾與一武漢居住者有接觸，1月24日出現(xiàn)咽痛，未予重視，1月25日出現(xiàn)咳嗽，咳黃痰，無乏力、發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛等。自行服用“蓮花清瘟膠囊”和“銀黃顆?！彼幬锖罂人源螖?shù)有所減少，痰易咳出。1月28日出現(xiàn)胃脹、腹瀉，起初為水樣，后為質(zhì)稀。于2月1日在本院發(fā)熱門診進(jìn)一步診治。

入院后查體：體溫37.0 ℃，脈搏113 次/分，呼吸20 次/分，血壓128/84 mm Hg，指氧飽和度99%。實(shí)驗(yàn)室檢查(血常規(guī)+C-反應(yīng)蛋白)：白細(xì)胞總數(shù)6.15×109/L，嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)0.01×109/L，嗜酸性粒細(xì)胞百分比0.2%，淋巴細(xì)胞百分比29.4%，紅細(xì)胞4.11×1012/L，血紅蛋白128 g/L，血小板106×109/L，C-反應(yīng)蛋白42.1 mg/L。肝功能及腎功能未見明顯異常。心肌酶譜：肌酸激酶72 IU/L，肌酸激酶同工酶-MB 21.8 IU/L，乳酸脫氫酶302 IU/L，肌紅蛋白33 μg/L。肺炎支原體免疫球蛋白M 0.17 S/Co，免疫球蛋白G 63 IU/mL，肺炎衣原體免疫球蛋白M 0.07 S/Co，免疫球蛋白G 69 IU/mL；輸血前四項(xiàng)(乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體抗體)未見異常。胸部CT：雙肺多發(fā)斑片及片狀密度影，考慮感染，不排除病毒性肺炎，隔離病房留觀，見圖1。

注：A表示冠狀位重組圖；B表示橫斷位圖。

圖1病例1的CT影像學(xué)檢查結(jié)果

為進(jìn)一步明確診斷，于2月2日采取咽拭子標(biāo)本，采用手工磁珠法提取核酸，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測SARS-CoV-2核酸(靶標(biāo)包括SARS-CoV-2 ORF 1ab及編碼核衣殼蛋白N基因)。結(jié)果顯示SARS-CoV-2 ORF 1ab及編碼核衣殼蛋白N基因2種靶標(biāo)均有典型S型擴(kuò)增曲線[循環(huán)閾值(Ct值)<40]，見圖2。經(jīng)專家組會診，患者2月2日晚上出現(xiàn)發(fā)熱(38.2 ℃)，結(jié)合其他臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、接觸史及SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果確診為COVID-19。

為進(jìn)一步驗(yàn)證患者其他體液及糞便標(biāo)本中能否檢出SARS-CoV-2核酸，于2月4日早晨采集患者乙二胺四乙酸抗凝全血、尿液和糞便標(biāo)本，分別進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測。其中糞便標(biāo)本用生理鹽水預(yù)處理制備糞便混懸液，離心后取上清，備用。后續(xù)核酸提取和PCR檢測方法同上述咽拭子的處理方法。該患者全血和尿液標(biāo)本中未檢出SARS-CoV-2核酸，但糞便中SARS-CoV-2 ORF 1ab及編碼核衣殼蛋白N基因2種靶標(biāo)均有典型S型擴(kuò)增曲線(Ct值<40)，見圖2。

注：A表示咽拭子；B表示糞便；C表示全血；D表示尿液；NC表示內(nèi)參基因；SARS-CoV-2 ORF 1ab表示開放讀碼框1a/b基因；SARS-CoV-2表示核衣殼蛋白N基因。

圖2病例1的4種標(biāo)本SARS-CoV-2核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果擴(kuò)展曲線

病例2：男，39歲，與病例1為夫妻關(guān)系。主訴“咳嗽、咳痰5 d”?；颊咦栽V2020年1月22日曾與一武漢居住者有接觸，與其妻子同住。1月29日出現(xiàn)咳嗽，咳少量黃色膿痰，伴全身酸痛，無惡寒、發(fā)熱等其余不適。自服“銀花清肺膠囊”和“蓮花清瘟膠囊”后咳嗽、咳痰較前好轉(zhuǎn)，改服“銀黃顆?！薄?月1日開始出現(xiàn)鼻塞、咽痛，胸背部酸脹感，自覺燥熱，無惡寒、發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹脹、腹瀉等其余不適，食欲、睡眠欠佳，精神一般，大小便正常。于2月3日于本院發(fā)熱門診進(jìn)一步診治。

入院后查體：體溫37.0 ℃，脈搏 86 次/分，呼吸18 次/分，血壓126/84 mm Hg，指氧飽和度99%。實(shí)驗(yàn)室檢查(血常規(guī)+C-反應(yīng)蛋白)：白細(xì)胞3.52×109/L，嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)0.01×109/L，嗜酸性粒細(xì)胞百分比0.2%，單核細(xì)胞百分比10.3%，淋巴細(xì)胞總數(shù)0.94×109/L，血小板78×109/L，C-反應(yīng)蛋白6.48 mg/L。肝功能、腎功能、心肌酶、降鈣素原及D-二聚體未見異常。胸部CT：雙肺下葉后基底段斑片狀高密度影，考慮感染，不排除病毒性肺炎；雙肺多發(fā)小結(jié)節(jié)影，右肺上葉及下葉背段病灶考慮結(jié)核可能性大，見圖3。隔離病房留觀。

注：A表示冠狀位重組圖；B表示橫斷位圖。

圖3病例2的CT影像學(xué)檢查結(jié)果

為進(jìn)一步明確診斷，于2月3日采集患者咽拭子標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(方法同病例1)，核酸結(jié)果為陰性。2月4日再次采集患者咽拭子、乙二胺四乙酸抗凝全血、尿液及糞便標(biāo)本分別進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(方法同病例1)，咽拭子PCR結(jié)果中內(nèi)參基因未起峰，在排除了檢驗(yàn)操作和試劑問題后，考慮為取樣不合格；全血和尿液標(biāo)本中未檢出SARS-CoV-2核酸，但糞便中SARS-CoV-2 ORF 1ab及編碼核衣殼蛋白N基因2種靶標(biāo)均有典型S型擴(kuò)增曲線(Ct值<40)，見圖4。經(jīng)專家組會診，該病例有明確的接觸史，結(jié)合其他臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及SARS-CoV-2糞便標(biāo)本中核酸檢測結(jié)果，確診為COVID-19。

注：A表示第1次咽拭子；B表示第2次咽拭子；C表示糞便；D表示全血；E表示尿液；NC表示內(nèi)參基因；SARS-CoV-2 ORF 1ab表示開放讀碼框1a/b基因；SARS-CoV-2表示核衣殼蛋白N基因。

圖4病例2的4種標(biāo)本SARS-CoV-2核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果擴(kuò)展曲線

2 討 論

COVID-19疫情在中國已進(jìn)入關(guān)鍵時(shí)期，及時(shí)、早期診斷是疫情防控工作中的重要環(huán)節(jié)。在臨床診療過程中，僅依靠臨床癥狀或者實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查及影像學(xué)檢查均不能作為確診COVID-19的準(zhǔn)確依據(jù)，而檢出SARS-CoV-2核酸是確診COVID-19的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，及時(shí)、準(zhǔn)確的病毒核酸檢測不僅為盡早采取隔離措施，進(jìn)行及時(shí)、有效治療、阻止疫情進(jìn)一步擴(kuò)大發(fā)揮至關(guān)重要的作用，也為重新識別與患者密切接觸、被隔離的大量觀察者節(jié)省寶貴的醫(yī)療資源。

針對SARS-CoV-2核酸檢測，目前已有多家公司開發(fā)出實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑，但近期有媒體及專家反映SARS-CoV-2核酸陽性率偏低，有的病例重復(fù)檢測多次陰性后又出現(xiàn)陽性結(jié)果。也有醫(yī)生反映咽拭子標(biāo)本多次檢測陰性但最后在呼吸道灌洗液標(biāo)本中檢出陽性結(jié)果，以及CT影像篩查出現(xiàn)COVID-19特征但核酸檢測為陰性等問題。為了評估和驗(yàn)證不同類型標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸檢出情況，本研究在確診的2例COVID-19患者采集了4種不同類型標(biāo)本分別進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測，這2例患者糞便標(biāo)本均檢出核酸陽性，特別是病例2，第1次取咽拭子標(biāo)本，結(jié)果為陰性；次日再取咽拭子，內(nèi)參基因未起峰，已排除本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑問題，所以判斷為咽拭子取樣不合格或咽拭子取樣時(shí)存在影響PCR的抑制劑，但同批次檢測的該患者糞便標(biāo)本為陽性結(jié)果。這提示筆者有以下幾點(diǎn)值得重視：(1)標(biāo)本采集方法和類型的問題：咽拭子取樣必須遵照取樣操作規(guī)范，最好同時(shí)取口咽拭子和鼻咽拭子放在同一根保存管中，以提高病毒檢出率；糞便標(biāo)本用于檢測SARS-CoV-2核酸的價(jià)值值得重視。糞便取樣方便，且不像咽拭子標(biāo)本對取樣要求高，糞便標(biāo)本的量和質(zhì)容易得到滿足。(2)患者的病情和病程：不同病程、不同病情患者體內(nèi)的病毒存在量可能不同，在疾病的早期或輕癥患者，口/鼻咽部可能病毒載量低，造成核酸檢測假陰性結(jié)果，這時(shí)選擇糞便標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測可能是較好的策略，而不論其是否有腹瀉等消化道癥狀。(3)關(guān)于試劑和檢測的問題：選擇質(zhì)量可靠、有保證的檢測試劑。選擇至少含SARS-CoV-2基因的2個(gè)位點(diǎn)(開放讀碼框1a/b、核衣殼蛋白N或E結(jié)構(gòu)蛋白)[4]。選擇內(nèi)參基因?yàn)閮?nèi)源性內(nèi)參，而非人工加入的外源性內(nèi)參，以排除取樣不合格造成的結(jié)果假陰性問題。具體核酸檢測的質(zhì)量控制參照由中華醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》[5]。

本文中的2例確診病例并沒有明顯的發(fā)熱，只有輕微的上呼吸道癥狀，有病毒性肺炎的影像學(xué)改變，因此，在診斷COVID-19需要結(jié)合呼吸道癥狀、CT影像學(xué)檢查及SARS-CoV-2核酸結(jié)果綜合判斷。同時(shí)，筆者建議在無法獲得下呼吸道標(biāo)本的情況下，同時(shí)送檢口/鼻咽拭子標(biāo)本和糞便標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測，以期提高核酸檢測的陽性率。由于只有2例確診病例的糞便檢測結(jié)果，尚還不具代表性，期待更多的臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

志謝:

感謝湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科沈宏榮教授為本文提供的CT影像學(xué)資料！