錢景富，賀永明，楊柏松，王 晶，王雅華,*

（1.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營口 115009；2.遼源市東豐縣東豐鎮(zhèn)畜牧站，吉林 遼源 136300；3.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266032）

雞新城疫（ND）和禽流感（AI）仍是制約我國養(yǎng)雞行業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病，常以單獨(dú)或混合感染的方式感染家禽，發(fā)病率和死亡率都很高，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán)重。目前對(duì)這兩種傳染病尚無有效藥物治療，采取被動(dòng)免疫是一種有效的措施，我國已有卵黃抗體（IY）上市，對(duì)防治ND和AI發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)有的商品化IgY主要是液體制劑，通過注射方法使用，注射時(shí)雞群易受到抓雞驚嚇導(dǎo)致應(yīng)激綜合癥，連續(xù)注射針頭更換不及時(shí)也易造成交叉感染導(dǎo)致疾病傳播，同時(shí)免疫注射工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，勞動(dòng)力成本增加，如果操作不正確，會(huì)造成注射部位感染化膿、產(chǎn)生腫塊、形成肉瘤、造成跛行等等，甚至?xí)鹚劳觥Ｒ虼吮狙芯吭贗gY劑型、使用途徑上進(jìn)行創(chuàng)新研究，制備IgY凍干粉劑，通過拌料或者飲水方式免疫，更適合現(xiàn)代規(guī)模化雞場使用，減少免疫注射帶來的弊端。為此我們進(jìn)行了抗新城疫-禽流感（H5、H7、H9）多價(jià)二聯(lián)卵黃抗體凍干粉劑的研制及口服應(yīng)用試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

20日齡健康雛雞10只，要求新城疫和禽流感HI效價(jià)均小于3lg2；100日齡雞新城疫和禽流感免疫健康蛋雞80只。

1.2 免疫疫苗

新城疫一禽流感H9亞型二聯(lián)滅活苗、重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株），均購自市場上正規(guī)流通合格產(chǎn)品。

1.3 主要試劑

雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)（HI）標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、禽流感H9亞型HI標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、禽流感H7亞型HI標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（H7N9 H7-Re1株）、禽流感H5亞型HI標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（Re-8株）、生理鹽水、l%紅細(xì)胞懸液、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪胨瓊脂（G.A）、葡萄糖蛋白胨湯（G.P）、正辛酸、甲醛、吐溫-80等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 強(qiáng)化免疫

對(duì)免疫蛋雞群進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。每隔2周進(jìn)行1次強(qiáng)化免疫，免疫疫苗為新城疫一禽流感H9亞型二聯(lián)滅活苗和重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株），肌肉注射。

2.2 抗體效價(jià)檢測

第3次免疫后7 d收集卵黃，通過HI檢測ND與AI卵黃抗體效價(jià)，當(dāng)新城疫和禽流感H9亞型抗體效價(jià)達(dá)12lg2、禽流感H7亞型（H7N9 H7-Re1株）和禽流感H5亞型（Re-8株）抗體效價(jià)均在10lg2及以上開始收集高免雞蛋。

2.3 卵黃抗體制備

2.3.1 收集卵黃

將合格的高免蛋用清水洗凈，然后置0.1%新潔爾滅溶液中浸泡15 min，取出晾干。除去蛋清和系帶，收集蛋黃，充分?jǐn)嚢枋沟包S呈均勻膏狀。

2.3.2 萃取

將收集的卵黃加入8倍體積的PH4.2的注射用水，攪拌混勻后，4～8℃靜置24h，低溫離心分離上清液，收集于滅菌容器中。

2.3.3 滅活

將收集的上清液，加入辛酸至終濃度為0.02%，攪拌混勻，室溫放置2～4h滅活。最后按終濃度為0.05%加入甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杌靹?，室溫密?4h，再次滅活。

2.3.4 除菌過濾

用0.22μm微孔濾器過濾除菌。

2.3.5 冷凍干燥

加入吐溫-80和蔗糖作為穩(wěn)定劑，放入冷凍真空干燥機(jī)進(jìn)行凍干。

2.4 卵黃抗體質(zhì)量檢驗(yàn)

2.4.1 物理性狀

白色微黃色干粉。

2.4.2 無菌檢驗(yàn)

在無菌條件下進(jìn)行，將卵黃抗體凍干粉稀釋10倍，取1mL接種于T.G培養(yǎng)基小瓶，37℃培養(yǎng)，3 d后移植T.G、G.A小管各2支，每支0.2 mL，置37℃、25℃各一支；再取樣品0.2 mL直接接種G.P小管1支，置25℃。均培養(yǎng)5 d。觀察是否有細(xì)菌生長。

2.4.3 安全檢查

用20日齡健康易感雛雞10只，每只雞口服10個(gè)使用劑量，觀察2周。觀察雛雞精神狀態(tài)和死亡情況。

2.4.4 效力檢驗(yàn)

用HI檢測雞新城疫和禽流感抗體效價(jià)。

2.5 抗體粉臨床應(yīng)用效果觀察

將抗新城疫、禽流感（H5、H7、H9）多價(jià)二聯(lián)卵黃抗體在蛋雞和肉雞中進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn)，觀察其臨床效果。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 卵黃抗體質(zhì)量檢驗(yàn)

3.1.1 無菌檢驗(yàn)

雞新城疫-禽流感二聯(lián)卵黃抗體接種T.G、G.A和G.P培養(yǎng)基培養(yǎng)，均無細(xì)菌生長。

3.1.2 安全檢查

口服雞新城疫-禽流感二聯(lián)卵黃抗體的雛雞連續(xù)觀察2周，未見異常表現(xiàn)，全部健活。

3.1.3 效力檢驗(yàn)

ND抗體效價(jià)平均為13.75lg2，AIH9抗體效價(jià)平均為12.50lg2，AIH7（Re-1株）抗體效價(jià)平均為10.25lg2、AIH5（Re-8株）抗體效價(jià)平均為10.725lg2。

3.2 抗體臨床應(yīng)用效果

臨床應(yīng)用抗雞新城疫-禽流感（H5、H7、H9）二聯(lián)卵黃抗體結(jié)果顯示，該卵黃抗體對(duì)ND和AI防治效果顯著。治療時(shí)采用飲水方式添加，發(fā)病早期使用二聯(lián)卵黃抗體后可控制感染雞群不再發(fā)??；發(fā)病中期，使用抗體治療1次感染雞群死亡率得到控制，連續(xù)使用2次抗體治療，第4 d基本痊愈；發(fā)病晚期雞群使用卵黃抗體治療效果不明顯。治療使用劑量雛雞每只雞0.10g～0.15g，青年雞每只雞0.15g～0.20g，體重在2.5 kg以上的雞使用劑量為0.20g～0.25g；緊急預(yù)防采用拌料方式添加，根據(jù)體重每只雞使用劑量在0.10g～0.20g之間，使用1次抗體即可，還要進(jìn)行疫苗接種，產(chǎn)生主動(dòng)免疫。

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，使用抗新城疫、禽流感（H5、H7、H9）多價(jià)二聯(lián)卵黃抗體對(duì)ND和AI的預(yù)防保護(hù)率達(dá)到95%以上，發(fā)病初期治愈率可達(dá)到95%以上，發(fā)病中期治愈率80%～90%之間，晚期效果不理想，說明越早應(yīng)用抗體效果越好。本研究通過飲水或拌料方式使用IgY防治ND、AI效果理想，即節(jié)省人力，又減少注射和抓雞造成的應(yīng)激反應(yīng)。IgY與一般哺乳動(dòng)物IgG相比，IgY具有較強(qiáng)的耐熱、耐酸、抗離子強(qiáng)度和一定的抗酶降解能力[1]，IgY對(duì)消化酶具有一定的抵抗作用，因此適合在飼料和飲水中添加使用[2]。抗體具有中和相應(yīng)病原體的特性，適時(shí)給機(jī)體輸入抗體，可使易感動(dòng)物的病毒感染呈現(xiàn)預(yù)防乃至治療作用[3]。進(jìn)入腸道的IgY可直接中和雞新城疫病毒和禽流感病毒，使病毒不能黏附和進(jìn)入腸道黏膜上皮細(xì)胞，導(dǎo)致病毒不能大量復(fù)制，起到預(yù)防作用。抗體也能透過毛細(xì)血管壁，分布于細(xì)胞外液和血流中，可中和體內(nèi)細(xì)胞外液病毒，起到治療作用，有研究表明：IgY在腸道消化酶作用下，降解為Fab和F c片段，可變小Fab部分很容易被腸道吸收，進(jìn)入機(jī)體后能與相應(yīng)的病原菌黏附因子結(jié)合，使病原菌不能黏附易感細(xì)胞而失去致病性，而IgY的穩(wěn)定區(qū)F c部留在腸內(nèi)[4]。但是IgY應(yīng)用屬于被動(dòng)免疫，見效快，無任何毒副作用，缺點(diǎn)是維持時(shí)間短，因此，臨床IgY多用于治療或者緊急預(yù)防接種，雞群仍然需要疫苗免疫，一般是使用抗體7 d后再用疫苗人工主動(dòng)免疫[5]。

由于食品安全、耐藥性問題，“無抗日糧、減抗養(yǎng)殖”是養(yǎng)殖業(yè)必然發(fā)展趨勢，目前歐盟及我國已禁在飼料中添加抗生素，利用非藥物添加劑替代抗生素已成為必然趨勢[6-7]。IgY因具有零副作用、低成本、耐熱性和較高的抵抗力，加之采集方便以及不受地域 限制等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病的預(yù)防和治療的過程中必將發(fā)揮重要的功效，具有非常大的使用價(jià)值。