西 娜，趙冠人，陳 明，張 策，王雅薇，吳首蓉

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心藥劑科，北京 100091)

2017年，世界范圍內(nèi)有1 000萬例結(jié)核病新發(fā)病例，使結(jié)核病成為全球第二大致死的傳染性疾病，且95%的患者都集中在發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)結(jié)核病患者數(shù)居全球第2位[1]。結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌通過淋巴系統(tǒng)或血液系統(tǒng)進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔后引起的腦膜和脊髓膜的慢性非化膿性炎癥反應(yīng)[2]，占所有結(jié)核病相關(guān)死因的1.5%～3.2%[3]。即便得到全力救治，仍有>16%的TBM患者最終死亡；而且>27%的痊愈患者可能患有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[4]。目前，關(guān)于TBM的研究較少，既沒有規(guī)范的治療方案，也沒有客觀的療效標(biāo)準(zhǔn)，治療大多參照肺結(jié)核的方案進(jìn)行[5]。由于存在血-腦脊液屏障，抗結(jié)核藥在腦脊液中的濃度通常僅為血液中藥物濃度的20%～90%[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在腦膜正常的情況下，一些藥物可以透過血-腦脊液屏障；但在病理狀態(tài)下，由于腦膜的破壞，血-腦脊液屏障對(duì)藥物的屏蔽作用有所減弱，進(jìn)入腦組織的藥量將會(huì)增加[7]。由于腦膜破壞的程度各異，增加的藥量可能不同。一線抗結(jié)核藥異煙肼(INH)、利福平(REP)、吡嗪酰胺(PZA)及乙胺丁醇(EMB)等屬于濃度依賴型抗菌藥物，病灶部位藥物濃度不足可能導(dǎo)致治療失敗甚至產(chǎn)生耐藥，濃度過高則可能出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，保持腦脊液中適宜的抗結(jié)核藥濃度對(duì)TBM的治療尤為重要。目前，關(guān)于測(cè)定腦脊液中抗結(jié)核藥濃度的文獻(xiàn)甚少[8-10]。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,HPLC-MS/MS)的方法，建立了可同時(shí)測(cè)定人腦脊液中一線抗結(jié)核藥INH、REP、PZA及EMB濃度的高通量檢測(cè)方法，通過測(cè)定人腦脊液中各藥物含量，為臨床個(gè)體化用藥提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 儀器

3200 Q TRAP LC/MS/MS系統(tǒng)+電噴霧電離(AB SCIEX公司)；5417型臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；不同規(guī)格的移液器(Eppendorf公司)；Milli-Q超純水儀(默克公司)。

1.2 藥品與試劑

INH、REP、PZA、EMB及對(duì)乙酰氨基酚(IS)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)依次為100578-201501、130496-201502、100178-201503、100165-201504及100018-201508。甲醇(Fisher)為色譜純，購(gòu)自Sigma公司；空白腦脊液由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)：選用Turbo Ion Spray為離子源，離子化電壓為5 500 V，離子源溫度為450 ℃，源內(nèi)氣體(GS1為40 psi；GS2為45 psi)，氣簾氣為25 psi。采用正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)掃描。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各種抗結(jié)核藥及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Mass spectrometry parameters of anti-tuberculosis drugs and internal standards

2.1.2 色譜參數(shù)：選用Poroshell 120SB C18柱為色譜柱(Agilent，4.6 mm×50 mm，2.7 μm)，甲醇-0.2%醋酸溶液為流動(dòng)相，室溫(25 ℃)條件下進(jìn)行梯度洗脫，流速0.5 ml/min；進(jìn)樣量5 μl。其中，洗脫條件中有機(jī)相甲醇比例如下，0.01 min：5%；2.50 min：18%；5.00 min：36%；6.00 min：70%；6.01 min：80%；9.00 min：90%；9.01 min：5%；12.00 min：5%。

2.2 溶液制備

精確稱量INH 9.8 mg、REP 30.0 mg、PZA 50.0 mg和EMB 8.0 mg，置于100 ml容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度依次為INH 98 μg/ml、REP 300 μg/ml、PZA 500 μg/ml及EMB 80 μg/ml的母液。對(duì)上述母液用50%甲醇進(jìn)行稀釋，得到各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，INH質(zhì)量濃度依次為1.96、4.9、9.8、19.6、49.0、78.4及98.0 μg/ml，REP質(zhì)量濃度依次為6.0、15.0、30.0、60.0、150.0、240.0及300.0 μg/ml，PZA質(zhì)量濃度依次為10.0、25.0、50.0、100.0、250.0、400.0及500.0 μg/ml，EMB質(zhì)量濃度依次為1.6、4.0、8.0、16.0、40.0、64.0及80.0 μg/ml。精確稱量IS 1.61 mg置于100 ml容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為16.1 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。上述試藥均置于6 ℃冰箱保存。

2.3 樣品處理

精確量取100 μl腦脊液，向其中加入10 μl內(nèi)標(biāo)溶液，加入300 μl甲醇進(jìn)行蛋白沉淀，經(jīng)渦旋離心后，取上清液200 μl，并用400 μl超純水稀釋混勻后，進(jìn)樣分析。

2.4 方法專屬性考察

分別取人空白腦脊液、加入標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的腦脊液和實(shí)際服用抗結(jié)核藥物的腦脊液，依照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，按照“2.1”分析條件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，各試樣得到良好分離，內(nèi)源性物質(zhì)不影響各物質(zhì)定量分析，見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

量取90 μl空白腦脊液7份，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μl，得到不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣。其中，INH質(zhì)量濃度依次為0.196、0.49、0.98、1.96、4.90、7.84及9.8 μg/ml；REP質(zhì)量濃度依次為0.60、1.5、3.0、6.0、15.0、24.0及30.0 μg/ml；PZA質(zhì)量濃度依次為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、40.0及50.0 μg/ml；EMB質(zhì)量濃度依次為0.16、0.4、0.8、1.6、4.0、6.4及8.0 μg/ml。依照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析。各標(biāo)品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(U)與濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得各自線性方程分別為：UINH=0.397C-0.0145，r=0.999 0，線性范圍0.196～9.8 μg/ml；UREF=0.225C-0.042 4，r=0.999 1，線性范圍0.60～30.0 μg/ml；UPZA=0.105C-0.005 49，r=0.998 5，線性范圍1.0～50.0 μg/ml；UEMB=0.109C+0.009 52，r=0.996 7，線性范圍0.16～8.0 μg/ml。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

首先將空白腦脊液用甲醇按照1∶3的比例進(jìn)行蛋白沉淀后，量取90 μl上清液3份，分別加入低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度的各藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl，混勻，得低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度INH(0.49、1.96及7.84 μg/ml)、REP(1.5、6.0及24.0 μg/ml)、PZA(2.5、10.0及40.0 μg/ml)和EMB(0.4、1.6及6.4 μg/ml)的腦脊液樣品，依照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析并記錄峰面積A1。另以50%甲醇溶液為基質(zhì)，同樣配置上述各濃度樣品，記錄各自峰面積A0，基質(zhì)效應(yīng)=A1/A0×100%。各藥物在人腦脊液中的基質(zhì)效應(yīng)：INH為(97.3±1.56)%，REP為(96.7±1.87)%，PZA為(97.6±1.53)%，EMB為(94.5±1.7)%，該結(jié)果表明腦脊液基質(zhì)不影響各藥物的定量分析。

A.空白腦脊液；B.加入標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的腦脊液；C.服用抗結(jié)核藥物的腦脊液;質(zhì)譜峰從左至右依次為：乙胺丁醇、異煙肼、吡嗪酰胺、內(nèi)標(biāo)-對(duì)乙酰氨基酚、利福平A. blank cerebrospinal fluid; B. cerebrospinal fluid added with standards and internal standards; C. cerebrospinal fluid taken with anti-tuberculosis drugs; the mass spectrum peaks from left to right are: ethambutol, isoniazid, pyrazinamide, internal standard-acetaminophen, rifampin圖1 質(zhì)譜圖Fig 1 Mass spectrum

2.7 精密度考察

量取90 μl空白腦脊液3份，分別加入低、中及高3個(gè)濃度的各藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl，混勻，得低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度INH(0.49、1.96及7.84 μg/ml)、REP(1.5、6.0及24.0 μg/ml)、PZA(2.5、10.0及40.0 μg/ml)和EMB(0.4、1.6及6.4 μg/ml)的腦脊液樣品，依照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，每個(gè)質(zhì)量濃度日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，連續(xù)進(jìn)樣5 d。結(jié)果表明，各藥物日內(nèi)及日間精密度的RSD均<10%，見表2。

2.8 提取回收率考察

量取90 μl空白腦脊液3份，分別加入低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度的各藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl，混勻，得低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度INH(0.49、1.96及7.84 μg/ml)、REP(1.5、6.0及24.0 μg/ml)、PZA(2.5、10.0及40.0 μg/ml)和EMB(0.4、1.6及6.4 μg/ml)的腦脊液樣品，依照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析并記錄峰面積A2。另以已經(jīng)過甲醇沉淀蛋白的空白腦脊液上清液為基質(zhì)，同樣配制上述各質(zhì)量濃度，依照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析并記錄峰面積A1，提取回收率=A2/A1×100%，結(jié)果見表2?？梢?，按照實(shí)驗(yàn)開發(fā)的腦脊液處理方法，各藥物提取回收率高，損失較小。

表2 精密度考察及提取回收率結(jié)果Tab 2 Precision and recovery results

2.9 穩(wěn)定性考察

量取90 μl空白腦脊液3份，分別加入低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度的各藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl，混勻，得低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度INH(0.49、1.96及7.84 μg/ml)、REP(1.5、6.0及24.0 μg/ml)、PZA(2.5、10.0及40.0 μg/ml)和EMB(0.4、1.6及6.4 μg/ml)的腦脊液樣品，依照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品后，分別考察室溫放置24 h、經(jīng)過3次凍融后各藥品的穩(wěn)定性。按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)及各狀態(tài)下各藥物濃度并與0時(shí)刻比較，變化率均<10%，表明在上述貯存條件下樣品較為穩(wěn)定，不影響本方法對(duì)樣本的準(zhǔn)確測(cè)定。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

目前，國(guó)內(nèi)外最常用的藥物濃度分析方法有高效液相色譜法、限進(jìn)性液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和熒光分光光度法等[11]。每種方法改變其中的條件，所得出的結(jié)果也會(huì)有所不同，因此，在測(cè)定藥物的濃度時(shí)，不止需要找到合適的檢測(cè)方法，還需找到測(cè)定結(jié)果的影響因素，通過改變這些條件來改進(jìn)方法。4種抗結(jié)核藥中，EMB沒有紫外吸收，對(duì)于其測(cè)定，大都采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12]，測(cè)定結(jié)果較好，具有特異性，但是靈敏度低?？梢愿鶕?jù)測(cè)定藥物的特點(diǎn)，從色譜方法、質(zhì)譜方法、樣品制備方法和避免低濃度樣品污染4個(gè)方面來聯(lián)合提高藥物檢測(cè)靈敏度[13]。為了能夠同時(shí)測(cè)定4種藥物含量，本研究采用HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在分析藥物及其在各種復(fù)雜生物基質(zhì)中的代謝產(chǎn)物時(shí)，由于其選擇性強(qiáng)、靈敏度高，不僅可以避免復(fù)雜、繁瑣且耗時(shí)的樣品前處理工作，而且能分離鑒定以往難于辨識(shí)的痕量藥物代謝產(chǎn)物[14]。

同時(shí)，由于抗結(jié)核藥極性差異較大，為了獲得滿意的分離度及峰形，本研究分別對(duì)色譜柱及流動(dòng)相進(jìn)行選擇優(yōu)化。色譜柱方面，從柱長(zhǎng)及硅膠顆粒大小2個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化選擇，最終以Poroshell 120SB-C18色譜柱(Agilent，4.6 mm×50 mm，2.7 μm)為分析柱，ZORBAX SB C18柱(2.1 mm×12.5 mm，5 μm)為保護(hù)柱。流動(dòng)相方面，考慮到質(zhì)譜不能使用不能揮發(fā)的磷酸鹽體系，本研究嘗試了甲醇-水體系、甲醇-醋酸水溶液體系、乙腈-水體系及乙腈-醋酸水溶液體系等流動(dòng)相系統(tǒng)，最終選擇以甲醇-0.2%醋酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，該方法用時(shí)較短，分離度良好。本方法流速為0.5 ml/min，流速的大小也直接關(guān)系到色譜峰面積的響應(yīng)值。流速過大，會(huì)減少溶質(zhì)的縱向擴(kuò)散，不能使藥物與限進(jìn)性填料充分作用，樣品不能較多地被保留在柱上，而被流動(dòng)相沖出，從而降低腦脊液的濃度及響應(yīng)值，還會(huì)造成伸舌峰更加伸舌，拖尾峰更加拖尾的現(xiàn)象；流速過小，會(huì)延長(zhǎng)藥物濃度的分析時(shí)間[15]。

3.2 腦脊液處理方法的優(yōu)化

在腦脊液處理上，本研究嘗試了甲醇直接沉淀蛋白法與液-液萃取法兩種方法。甲醇直接沉淀蛋白法操作簡(jiǎn)單，雜質(zhì)較少，回收率高；而液-液萃取法操作繁瑣、雜質(zhì)較多，且樣品損失較大。故本研究采用甲醇直接沉淀蛋白法對(duì)腦脊液樣品進(jìn)行處理。REP具有光敏感性，在實(shí)驗(yàn)操作中要尤其引起注意，否則會(huì)引起藥物回收率降低，靈敏度下降[16]。

綜上所述，本方法穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，適合臨床腦脊液樣本的高通量分析。