葉俠，周琳，吳杰，陶敏

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州 215000

肺癌是世界上最常見的癌癥死亡原因之一，占癌癥死亡人數(shù)的1/4[1];據(jù)估計，全世界每年約有22.25萬新病例確診，肺癌患者5年生存率僅為18%[1]。在所有肺癌類型中，非小細胞肺癌約占85%，小細胞肺癌僅占15%[2]。肺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的機制復(fù)雜的過程[3,4]，因此發(fā)現(xiàn)早期標志物，識別更多靶點，對于肺癌患者個體化治療以及進一步了解肺癌發(fā)生發(fā)展機制至關(guān)重要。20世紀末，在Fritzler和Moroi的共同努力下，人們首次在硬皮病患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了著絲粒蛋白[5]，并注意到它們能結(jié)合在著絲粒DNA上，兩者組成的動粒在染色體分離和有絲分裂過程中起著關(guān)鍵作用,但是關(guān)于著絲粒蛋白K(CENPK)在肺癌中的研究較少。2019年4～10月，我們通過小干擾RNA(siRNA)使CENPK的表達下調(diào)，觀察si-CENPK轉(zhuǎn)染對人肺癌細胞系A(chǔ)549增殖、遷移和侵襲能力的影響，旨在為肺癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人肺癌細胞系A(chǔ)549及人源正常支氣管上皮細胞系細胞系HBE購自American Type Culture Collection(ATCC)。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Transwell小室從美國Invitrogen 公司購買；RNA抽提試劑盒及2×SYBR green PCR master mix均購自日本Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；siRNA-CENPK小干擾RNA及其陰性對照siRNA-NC由廣東市銳博科技有限公司設(shè)計合成；q-RTPCR引物由上海生工生物有限公司合成；CCK8購自中國Biosharp公司。細胞培養(yǎng)皿、六孔板均購自美國Coring公司；超凈工作臺購自美國Airtech公司；恒溫水浴箱購自蘇州伯西瓦爾公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、全自動酶標儀均購自美國Thermo公司；LighterCycle96實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 A549、HBE細胞中CENPK mRNA檢測方法 采用q-RTPCR法。收集組細胞并按照Taraka試劑盒步驟提取RNA.濃度和純度合格后，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進行PCR擴增。采用2-ΔΔCt法計算CENPK mRNA相對水平。實驗重復(fù)3次，以平均值作為最終結(jié)果。

1.3 A549細胞培養(yǎng)、分組及si-CENPK轉(zhuǎn)染 將A549細胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，當細胞融合度達90%時，0.25%胰酶(含EDTA)消化，1∶2傳代。取傳3～6代，生長狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長的A549細胞。轉(zhuǎn)染前1 d將A549細胞系接種于6孔板中，隨機分為si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組。si-CENPK實驗組轉(zhuǎn)染si-CENPK，si-NC陰性對照組轉(zhuǎn)染si-NC，空白對照組不予轉(zhuǎn)染，每孔約2×105個細胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔。當細胞融合度約為60%時將含雙抗及血清的培養(yǎng)基更換為無血清、無雙抗的1640培養(yǎng)基，各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒瞬時離心后按說明加入250 μL的RNase-free水稀釋,配制成儲存液，-20 ℃保存(儲存濃度為20 mol/L)。各用500 μL不含血清的Opti-MEM 培養(yǎng)液分別稀釋5 μL轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與5 μL的Lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫孵育5 min，再將兩者混合輕輕吹打混勻，室溫放置15 min并將混合液加到含1 mL無血清細胞培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染6 h后加含10%FBS、100 U/mL的培養(yǎng)基2 mL繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后棄去舊培養(yǎng)基并重新加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基2 mL于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集各組轉(zhuǎn)染細胞便于后續(xù)實驗。

1.4 轉(zhuǎn)染后的A549細胞CENPK mRNA檢測方法 采用q-RTPCR法。收集3組細胞并按照Taraka試劑盒操作流程提取RNA，經(jīng)Nanodrop1000分光光度計分析，OD260/OD280為1.8～2.0，即提取的RNA濃度和純度合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將提取RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按SYBRGreen說明進行PCR擴增，模板為cDNA。PCR反應(yīng)體系10 μL：2×SYBRGreen 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.3 μL，Reverse Primer 0.3 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，94 ℃、20 s，60 ℃、60 s，40個循環(huán)。以actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算CENPK相對水平。實驗重復(fù)3次，以平均值作為最終結(jié)果。引物序列：CENPK上游引物5′-GAAACACTCAC-CGATTCAAATG-3′，下游引物5′-GCTTTTGGAACTC-TTCTTTTCC-3′；actin上游引物5′-CTGGACTTCGAGCAAGAGATG-3′，下游引物5′-CTGGACTTCGAGCAAGAGATG-3′。

1.5 轉(zhuǎn)染后的A549細胞OD值測算方法 采用CCK8檢測法。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞，0.25%Trypsin(含EDTA)消化，10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸制成單細胞懸液，在96孔板中加入適量細胞懸液，每孔100 μL，每孔2×103個細胞，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h，每孔加入CCK-8，總量為10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長處的OD值，每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 轉(zhuǎn)染后的A549細胞細胞間距離測算方法 采用細胞劃痕實驗。預(yù)先準備材料marker筆，6孔板及直尺。直尺與6孔板水平方向平行，在6孔板背后，均勻劃橫線，間隔0.5～1 cm。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞制成單細胞懸液，6孔板中加入適量細胞懸液，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)以第2天融合率100%為宜，用200 μL滅菌槍頭垂直孔板底部劃直線，每孔約5～6條直線，盡量與在背面劃的橫線垂直。用PBS沖洗各孔細胞2遍，動作輕柔，目的去除細胞碎片及脫落細胞。加入2 mL無血清培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后0、48 h在顯微鏡下觀察細胞遷移情況并選擇合適視野及放大倍數(shù)拍照。使用Image J軟件打開圖片后，計算各組細胞間距離的均值。細胞遷移能力用各組細胞距離均值表示。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 轉(zhuǎn)染后的A549細胞穿膜細胞數(shù)測算方法 采用Transwell侵襲實驗。Transwell上室中加入1∶6(基質(zhì)膠∶DMEM)稀釋后的基質(zhì)膠50 μL，37 ℃、30 min使其凝固。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞，0.25%胰蛋白酶消化離心，所得沉淀使用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸并稀釋至1×106/mL，從中吸取100 μL細胞懸液加入到Transwell上室，注意不要有氣泡產(chǎn)生，并在下室內(nèi)加入600 μL含有10%FBS的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。24 h后取出培養(yǎng)板，吸棄上室內(nèi)培養(yǎng)基，Transwell小室上層用棉簽拭去，動作輕柔，防止未遷移的細胞和Matrigel基質(zhì)膠殘留，PBS沖洗2遍后使用甲醛固定，PBS再沖洗2遍后使用甲紫染色，倒置，晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞是否穿膜及穿膜情況，拍照并隨機選取3個不同高倍視野進行細胞數(shù)統(tǒng)計，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。以不同視野下穿膜細胞數(shù)平均值的多少作為細胞侵襲能力強弱的標準。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 A549細胞、HBE細胞中CENPK mRNA相對表達量比較 A549細胞、HBE細胞中CENPK mRNA相對表達量分別為2.710±0.153、1.000，兩者比較，P均<0.05。

2.2 各組CENPK mRNA相對表達量比較 si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組CENPK mRNA相對表達量分別為0.28±0.06、1.12±0.10、1.000，si-CENPK實驗組與其他兩組比較，P<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h各組OD值比較 轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h OD值比較見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h各組OD值比較

注：與其余兩組比較，*P<0.05。

2.4 各組轉(zhuǎn)染48 h細胞間距離比較 si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組轉(zhuǎn)染48 h細胞間距離分別為(0.70±0.02)、(0.34±0.03)、(0.37±0.06)cm，si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組比較，P<0.05。

2.5 各組轉(zhuǎn)染48 h穿膜細胞數(shù)比較 si-CENPK實驗組、si-NC陰性對照組、空白對照組轉(zhuǎn)染48 h穿膜細胞數(shù)分別為(89±10)、(163±12)、(168±11)個，si-CENPK實驗組與其他兩組比較，P均<0.05。

3 討論

肺癌是一種有多種亞型組成異質(zhì)性疾病，在所有惡性腫瘤中其病死率較高，具有獨特的生物學(xué)和臨床特征。目前，臨床上治療肺癌的方法主要有手術(shù)、放療、化療、靶向治療以及免疫治療等[6,7]，但近年來化療耐藥性的增加、靶向治療的抵抗和遠處轉(zhuǎn)移[8～10]，使肺癌的治療效果更差。因此，尋找新的生物標志物，為患者發(fā)現(xiàn)有效的個體化治療方法，是一項具有挑戰(zhàn)性且有意義的工作[11,12]。肺癌細胞系A(chǔ)549是1972年由Giard DJ從一位58歲男性通過肺癌組織移植培養(yǎng)建立的，有研究[3]報道指出CENPK在肺癌細胞系A(chǔ)549中高表達，但是對該細胞系具體的生物學(xué)行為卻未見報道。

近年來，著絲粒蛋白的研究取得了重大成就，很多研究闡明了它們在癌癥中的作用[13～15]。CENP家族蛋白是著絲粒蛋白的主要部分。著絲粒是染色體區(qū)域的一部分，可以使有絲分裂動粒聚集，以確保正確的染色體附著到微管上，并使姐妹染色單體分離[16]。著絲粒由超過80種不同的蛋白質(zhì)組成。許多蛋白質(zhì)在真核生物中是保守的。在細胞分裂過程中著絲粒蛋白附著在染色單體上，將姐妹染色單體分開。染色體異常分離和著絲粒檢查點蛋白缺陷定位可以導(dǎo)致非整倍體和染色體不穩(wěn)定，而非整倍體和染色體不穩(wěn)定已經(jīng)被確定為大多數(shù)實體腫瘤的標志，在很多癌癥中都能觀察到這種現(xiàn)象。CENPK又名AF5alpha、P33、ICEN37、FKSG14及Solt，位于染色體5q12.3，著絲粒的外層，有5個轉(zhuǎn)錄本，19個外顯子，分子量為31 kD，共269個氨基酸，是CENPH/I著絲粒復(fù)合體相關(guān)的亞單位，靶標是CENPA，具有維持適當?shù)膭恿９δ芎痛龠M有絲分裂進展的功能，廣泛存在于卵巢和骨髓中。有研究報道，CENPK在卵巢癌中高表達且與不良預(yù)后相關(guān)，促癌作用明確同時與CA125及HE4連用可以提高診斷卵巢癌的靈敏性[3]。也有文獻報道，下調(diào)CENPK的表達能通過使癌細胞停留在G0/G1期從而抑制三陰性乳腺癌的增殖能力。最新的報道指出，CENPK在肝癌細胞及組織中表達升高，CENPK的表達降低可以通過抑制YAP1抑制肝癌細胞惡性生物學(xué)行為從而抑制肝癌的進展，Liu等報道也指出CENPK在膀胱癌中高表達并且可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，但目前關(guān)于CENPK表達與肺癌細胞惡性生物學(xué)行為的報道較少。為明確CENPK在肺癌中的生物學(xué)功能，我們體外培養(yǎng)A549細胞及HBE，并將A549細胞轉(zhuǎn)染si-CENPK使其CENPK表達下調(diào)，進一步通過劃痕實驗、CCK8實驗、侵襲實驗研究，發(fā)現(xiàn)與正常支氣管上皮細胞HBE相比，CENPK在肺癌細胞中高表達；si-CENPK實驗組中CENPK mRNA相對表達量明顯低于其他兩組；si-CENPK實驗組細胞增殖遷移和侵襲能力明顯低于其他兩組。這表明CENPK在肺癌中發(fā)揮促癌基因樣作用明確，但目前CENPK下調(diào)抑制肺癌細胞增殖遷移和侵襲能力的機制尚不完全清楚，有待于進一步研究。

總之，si-CENPK轉(zhuǎn)染能夠抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲能力。