陳志晟　顏彥　趙思涵　田麗波　商?！『鷤?/p>

摘要：【目的】克隆木薯乙烯受體基因（MeETR1）并檢測其在木薯采后生理性變質（PPD）過程中的表達情況，為研究ETR基因家族在木薯PPD過程中的功能作用提供參考依據?！痉椒ā恳阅臼砥贩N華南8號為材料，應用PCR擴增MeETR1基因編碼區(qū)（CDS）序列，采用生物信息學分析方法對其編碼蛋白的理化性質、親/疏水性、保守結構域及二、三級結構等進行預測分析，通過亞細胞定位確定MeETR1蛋白在植物細胞中的表達分布，并利用實時熒光定量PCR檢測MeETR1基因在木薯采后PPD過程的表達情況。【結果】克隆獲得MeETR1基因CDS序列全長2220 bp，共編碼739個氨基酸，蛋白分子量為82.88 kD，理論等電點（pI）為6.76;MeETR1基因編碼蛋白屬于疏水蛋白，含有ETR1家族4個典型模塊，即GAF結構域、HisKA結構域、HATPase_c結構域和REC結構域;其二級結構中α-螺旋占47.43%、延伸鏈占14.46%、無規(guī)則卷曲占38.11%。MeETR1氨基酸序列（XP_021625986.1）與同屬大戟科的蓖麻（Ricinus communis）ETR1氨基酸序列（XP_002533252.1）相似性為92.42%，親緣關系較近;MeETR1蛋白定位在細胞質中。與0 h（PPD前）相比，MeETR1基因的相對表達量在木薯采后PPD過程中（12、24、48和96 h）均呈顯著下降趨勢（P<0.05），即MeETR1基因表達受木薯采后PPD過程的抑制?！窘Y論】MeETR1基因編碼蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結構域，與其他植物ETR1在生物學功能上具有一致性;MeETR1基因表達在木薯采后PPD過程中受抑制，可能在此過程中發(fā)揮負調控作用。

關鍵詞： 木薯;乙烯受體（ETR）;MeETR1基因;生理性變質（PPD）;表達分析

中圖分類號： S533.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0019-08

Abstract：【Objective】In this study， the cassava ethylene receptor gene named MeETR1 was cloned and its expression level during the post-harvest physiological deterioration（PPD） process of cassava was detected， which laid a foundation for studying the function of the ETR gene family in cassava PPD process. 【Method】The coding region（CDS） of MeETR1 gene was amplified from cassava variety SC8 by PCR method， and the physicochemical properties， hydrophili-city/hydrophobicity， conserved domains， secondary and tertiary structures， and phylogenetic relationship were analyzed by bioinformatics method. The distribution of MeETR1 protein in plant cells was determined by subcellular localization， and the expression pattern of MeETR1 gene in PPD process was detected by qPCR. 【Result】The CDS of MeETR1 gene was 2220 bp in length and encoded 739 amino acids. The protein molecular weight was 82.88 kD， and the theoretical isoelectric point （pI） was 6.76. MeETR1 gene encoded protein was hydrophobin and contained four typical modules of the ETR1 family， namely GAF domain， HisKA domain， HATPase_c domain and REC domain. In the secondary structure， the α-helix accounted for 47.43%， the extended chain accounted for 14.46%， and the irregular coil accounted for 38.11%. The amino acid sequence of MeETR1 （XP_021625986.1） was 92.42% similar to the amino acid sequence of Ricinus communis ETR1 （XP_002533252.1）， which had the close genetic relationship. Subcellular localization proved that MeETR1 was localized in the cytoplasm. The relative expression level of MeETR1 showed a significant declined trend during PPD process（12， 24， 48 and 96 h）（P<0.05） compared with 0 H（before PPD）， indicating MeETR1 gene was inhibited by cassava PPD process. 【Conclusion】The protein encoded by MeETR1 gene contains four typical domains including GAF， HisKA， HATPase_c and REC， and its biological function is consistent with other plant ETR1. MeETR1 gene is inhibited during the cassava PPD process and might play a negative role in regulating PPD of cassava storage roots.

Key words： cassava; ethylene receptor（ETR）; MeETR1 gene; post-harvest physiological deterioration（PPD）; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31801419）;General Program of Hainan Natural Science Foundation（317036）;Hainan Graduate Student Innovation Research Project（Hys2018-34）

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta）是大戟科木薯屬植物，具有抗旱、耐瘠薄、適應性廣及塊根淀粉含量高等特點（張鵬等，2014），但木薯塊根極不耐貯藏，采收后2～3 d即出現(xiàn)嚴重的生理性變質（Post-harvest physiological deterioration，PPD），也就是木薯塊根維管束出現(xiàn)褐變，且隨貯藏時間的延長而不斷加劇（Zidenga et al.，2012;Xu et al.，2013），嚴重制約了木薯產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。乙烯（Ethylene）是一種氣態(tài)的植物激素，其介導的信號通路在植物生長發(fā)育及逆境脅迫應答過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用（Hershkovitz et al.，2009;施怡婷和楊淑華，2016;趙赫等，2016;Ren et al.，2017）。乙烯受體蛋白（ETR）是乙烯信號轉導途徑中的關鍵元件之一，在調控植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫等過程中扮演重要角色（Zhou et al.，2007;Gao and Schaller，2009;Bisson and Groth，2010）。因此，對木薯乙烯受體ETR基因（MeETR）進行研究，可為揭示ETR在木薯PPD過程中的作用機制提供科學依據。【前人研究進展】乙烯受體根據其蛋白結構的不同，可分為ETR I家族受體和ETR II家族受體。ETR基因最先從擬南芥中克隆獲得（Gamble et al.，1998），之后相繼從橡膠樹（張桂和，2002）、香蕉（賀立紅等，2009）、水稻（黃溪，2016）和番茄（蘇麗艷，2019）等多種植物中克隆出多個家族成員，并證實了其在調控植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫中的功能作用。張桂和（2002）發(fā)現(xiàn)不同品種的橡膠樹在經乙烯處理后其HbETR1基因表達呈明顯的增加趨勢，說明橡膠樹對乙烯利刺激的反應較敏感;魏紹沖等（2004）研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃AdETR1基因在果實成熟過程中上調表達，說明AdETR1基因與果實成熟有關;謝永紅等（2005）研究表明，桃ETR1基因cDNA合成受溫度和赤霉素（GA3）的調節(jié)，而乙烯的合成能力隨ETR1基因表達量的上調而上升，即ETR1基因與乙烯合成有關;賀立紅等（2009）發(fā)現(xiàn)38 ℃熱處理能抑制香蕉MaETR1基因在果皮中的表達，而低溫處理可促進MaETR1基因在果皮中的表達;郝金鳳等（2012）通過分析甜瓜Cm-ETR2基因發(fā)現(xiàn)，Cm-ETR2基因在果實生長過程中的表達不斷增強，并證實其能延長果實的貯藏時間;李麗秀和賴鐘雄（2013）研究證實枇杷EjETR1a和EjETR2a基因在植株的生長發(fā)育及成熟衰老過程中起調控作用;黃溪（2016）通過研究水稻OsETR4基因發(fā)現(xiàn)，OsETR4基因在低溫脅迫下其表達量上升，進而增強水稻在發(fā)芽期及苗期的耐冷性;田曉巖等（2017）研究發(fā)現(xiàn)文心蘭時空特異性表達OnERS1基因與花衰老有關;李麗等（2018）研究表明芒果MiETR1基因參與果實成熟和衰老過程，并證實MiETR1能延長果實的貯藏時間;蘇麗艷（2019）從番茄克隆獲得SlETR6基因，且證實該基因參與番茄生長發(fā)育過程中的逆境調控?！颈狙芯壳腥朦c】上述研究結果均表明，ETR1基因家族在植物生長發(fā)育及逆境脅迫的應答中發(fā)揮重要作用，但至今有關MeETR1基因在木薯采后PPD過程中的作用機制尚無研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以木薯品種華南8號為材料，結合木薯全基因組和轉錄組數據，對MeETR1基因進行克隆及生物信息學分析，并通過實時熒光定量PCR檢測其在木薯采后PPD過程中的相對表達量，為研究ETR基因家族在木薯PPD過程中的功能作用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

木薯品種華南8號由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所提供。多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、DNA回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒及pMD18-T載體購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司，2×Taq MasterMix、ChamQ Universal SYBR RT-PCR MasterMix試劑盒及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司，農桿菌GV3101感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司，限制性核酸內切酶購自Thermo Fisher Scien-tific公司，亞細胞定位載體pNC-Green-SubN和Nimble Cloning試劑盒購自海南壹田生物科技有限公司。主要儀器設備：超微量紫外分光光度計（Thermo，美國），PCR儀（耶拿，德國），EPS300電泳儀（Tanon，上海），CT15RT高速冷凍離心機（TECHCOMP，中國），4100凝膠成像儀（Tanon，上海），F(xiàn)luoView FV1000激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，日本），MX3000熒光定量PCR儀（安捷倫，美國）。

1. 2 材料處理

選取外表皮無破損的木薯塊根，將其切下3～4片直徑在4 cm左右的塊根切片擺放在托盤中，置于溫度26 ℃、相對濕度75%、光周期16 L∶8 D的培養(yǎng)箱中，分別在貯藏0、12、24、48和96 h等時段取出木薯塊根，所有樣品均經液氮凍存后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 木薯總RNA提取及反轉錄

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取不同時段的木薯塊根RNA，采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并以超微量紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，用于后續(xù)基因克隆及表達分析。

1. 4 基因克隆與載體構建

結合木薯全基因組數據及本課題組前期的轉錄組數據，根據MeETR1基因編碼區(qū)（CDS）序列設計引物MeETR1-F和MeETR1-R（表1），以木薯塊根cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系25.0 μL：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下游引物（MeETR1-F和MeETR1-R）各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 160 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。符合預期大小的目的片段用DNA回收純化試劑盒進行回收純化，然后連接至pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑選單菌落進行菌液PCR檢測，陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，提取測序正確的陽性克隆質粒并保存用于后續(xù)研究。

1. 5 生物信息學分析

使用DNAMAN 6.0對MeETR1基因序列進行比對分析，通過EXPASY數據庫（http：//web.expasy.org/protparam/）分析其推導氨基酸序列的理化性質，以EMBNET數據庫分析其跨膜結構，運用CD-Search進行保守結構域分析;分別利用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對其編碼蛋白的二、三級結構進行預測分析;采用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索及比對分析同源序列，并以MEGA 7.0中的Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 6 亞細胞定位

根據MeETR1基因CDS序列設計引物（表1），以陽性克隆質粒為模板進行擴增，擴增產物經切膠回收純化后使用Nimble Cloning MIX試劑將其連接至pNC-Green-SubN表達載體中，構建植物表達載體pNC-Green-SubN-MeETR1，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)14 h，挑菌、搖菌后進行菌液PCR鑒定，將陽性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。經測序比對分析后，選取測序正確的陽性克隆質粒轉化農桿菌GV3101感受態(tài)細胞，使用瞬時轉化法分別將pNC-Green-SubN-MeETR1和空載pNC-Green-SubN（對照）轉入到煙草葉片中。25 ℃培養(yǎng)48 h后選取侵染的葉片制作切片，通過FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號在煙草葉片細胞中的分布情況。

1. 7 基因表達分析

以木薯TUB基因為內參基因，根據MeETR1基因CDS序列設計引物QMeETR1-F和QMeETR1-R（表1），通過實時熒光定量PCR檢測MeETR1基因在木薯采后PPD過程中的表達情況。實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL：熒光染料Mix 10.0 μL，正、反向引物（QMeETR1-F和QMeETR1-R）各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行40個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。每個樣品進行3次生物學重復，使用2-△△Ct法換算MeETR1基因的相對表達量（顏彥等，2018）。

2 結果與分析

2. 1 MeETR1基因克隆結果

以MeETR1-F和MeETR1-R為引物、木薯塊根cDNA為模板，PCR擴增獲得一條約2000 bp的目的基因條帶（圖1），經回收純化、連接至pMD18-T載體及轉化DH5α感受態(tài)細胞后，挑選陽性克隆進行測序，證實得到目的基因即為MeETR1基因（cassava4.1_002375m.g），其CDS序列為2220 bp，編碼739個氨基酸。

2. 2 MeETR1蛋白理化性質預測分析結果

MeETR1蛋白分子量為82.88 kD，理論等電點（pI）為6.76，原子總數為11819，化學式為C3727H6001N1003 O1050S38;其氨基酸成分中亮氨酸[Leu（L）]、纈氨酸[Val（V）]和丙氨酸[Ala（A）]的含量較高，分別占13.4%、9.3%和7.3%;蛋白脂肪系數為109.95，不穩(wěn)定系數值為45.64，屬于不穩(wěn)定蛋白。使用ProtScale預測MeETR1蛋白的親/疏水性，結果（圖2）表明，MeETR1蛋白的最大親水性為-2.767、最大疏水性為2.611，有82個氨基酸親水數峰在-1.000以下，有150個氨基酸疏水數峰在1.000以上，親水性氨基酸數目明顯少于疏水性氨基酸，為疏水蛋白。通過CD-Search預測MeETR1蛋白保守結構域和功能域，發(fā)現(xiàn)MeETR1蛋白包括4個典型模塊，即GAF結構域、HisKA結構域、HATPase_c結構域和REC結構域（圖3）。

2. 3 MeETR1蛋白二、三級結構預測結果

使用PRABI對MeETR1蛋白二級結構進行預測，結果（圖4）表明，MeETR1基因編碼蛋白二級結構中有351個α-螺旋（占47.43%）、107個延伸鏈（占14.46%）及281個無規(guī)則卷曲（占38.11%）。以SWISS-MODEL預測MeETR1蛋白三級結構，其結果（圖5）與二級結構預測結果一致。

2. 4 MeETR1氨基酸序列同源比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建

利用NCBI搜索與MeETR1氨基酸同源的氨基酸序列[蓖麻（Ricinus communis）、毛果楊（Populus trichocarpa）、梅（Prunus mume）、草莓（Fragaria x ananassa）、月季（Rosa chinensis）、龍眼木（Dimocarpus longan）、柑橘（Citrus sinensis）、芒果（Mangifera indica）、獼猴桃（Actinidia deliciosa）、葡萄（Vitis vinifera）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）]，進行多序列比對分析（圖6），并使用MEGA 7.0中的Neighor-joining法構建基于ETR1氨基酸序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖7），結果顯示，MeETR1氨基酸序列（XP_021625986.1）與同屬大戟科的蓖麻ETR1氨基酸序列（XP_002533252.1）相似性為92.42%，且位于同一進化分支上，即MeETR1與蓖麻ETR家族的親緣關系較近;與毛果楊（XP_002299688.1）、梅（XP_008218930.1）、草莓（CAC48384.1）、月季（XP_024181357.1）、龍眼木（ACL81480.3）、柑橘（KDO50509.1）、芒果（AIT39449.1）、獼猴桃（ABY 28264.1）、葡萄（CAN73257.1）的ETR1氨基酸序列相似性分別為88.77%、88.26%、87.85%、88.12%、88.39%、87.58%、86.52%、86.27%和85.70%，親緣關系相對較遠;與擬南芥（NP_176808.3）的ETR1氨基酸序列相似性為83.15%，親緣關系最遠。

2. 5 MeETR1蛋白亞細胞定位分析結果

將MeETR1基因CDS序列連接至攜帶有GFP熒光蛋白的pNC-Green-SubN表達載體中，成功構建了pNC-Green-SubN-MeETR1植物瞬時表達載體;然后以農桿菌注射侵染煙草葉片的方式進行亞細胞定位試驗，觀察GFP熒光信號在煙草葉片細胞中的分布情況，結果（圖8）顯示經pNC-Green-SubN-MeETR1侵染的煙草葉片在細胞質中出現(xiàn)明顯的綠色熒光信號，表明MeETR1基因編碼蛋白表達定位于細胞質中。

2. 6 MeETR1基因表達分析結果

MeETR1基因在木薯采后PPD過程中不同時段的表達情況如圖9所示。與0 h（PPD前）相比，MeETR1基因的相對表達量在PPD過程中（12、24、48和96 h）均呈顯著下降趨勢（P<0.05），表明MeETR1基因表達受木薯采后PPD過程的抑制，可能在此過程中發(fā)揮負調控作用。

3 討論

ETR是乙烯信號轉導途徑中一類包含多個基因的關鍵組分，其蛋白結構及基因時空表達方面各不相同，因此其家族成員在逆境脅迫中可能具有多種調控模式，在不同脅迫條件下ETR基因的調控模式存在明顯差異（Gao and Schaller，2009;Bisson and Groth，2010）。根據蛋白結構的不同通常將ETR分為兩個亞家族，其中，亞家族I受體（ETR1和ERS1）具有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結構域;亞家族II受體包括ETR2、ERS2和EIN4，其在N-末端具有額外的信號肽，且與亞家族I受體相比具有分叉的His激酶結構域（Yang et al.，2015）。ETR1參與植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫的多個過程，目前已從甜瓜、芒果和番茄等植物中克隆獲得ETR1基因，但關于MeETR1基因在木薯采后PPD過程中的功能作用研究尚無報道。本研究成功克隆獲得ETR1亞家族成員MeETR1基因的CDS序列，其長度為2220 bp，共編碼739個氨基酸，含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結構域;多序列比對分析發(fā)現(xiàn)MeETR1氨基酸序列與多個物種的ETR1氨基酸序列相似性較高，均在80.00%以上，表明不同植物的ETR在生物學功能上可能具有一致性（李麗等，2018）。MeETR1基因編碼蛋白定位于細胞質中，與擬南芥ETR1基因編碼蛋白定位在內質網上（Chen et al.，2002;Dong et al.，2008）有所不同，可能是用于侵染的植物不同所致（Dong et al.，2010），因此后續(xù)有待利用原生質體重新進行亞細胞定位分析。

ETR1作為乙烯信號轉導途徑的元件之一，在乙烯信號轉導過程中能直接與乙烯結合形成受體復合物，即ETR1在乙烯信號轉導途徑中發(fā)揮重要作用，因此MeETR1基因在木薯中的功能可能與其他植物ETR基因相似。本研究通過實時熒光定量PCR檢測分析MeETR1基因在木薯采后PPD過程中不同時段的表達譜，結果發(fā)現(xiàn)MeETR1基因在0 h（PPD前）的相對表達量最高，在PPD過程中（12、24、48和96 h）其相對表達量均呈顯著下降趨勢，推測MeETR1基因在木薯采后PPD過程中具有負調控作用。在今后的研究中可通過構建MeETR1基因過表達及干擾轉基因株系進一步解析MeETR1基因在木薯塊根采后PPD過程中的功能。

4 結論

MeETR1基因編碼蛋白含有GAF、HisKA、HATPase_c和REC等4個典型的結構域，與其他植物ETR1在生物學功能上具有一致性;MeETR1基因表達在木薯采后PPD過程中受抑制，可能在此過程中發(fā)揮負調控作用。

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（責任編輯 蘭宗寶）